簇毛麥絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶基因Stpk-V2、Stpk-V3的克隆與分析.pdf

1、小麥?zhǔn)鞘澜缟献钪饕募Z食作物之一，約35％-40％的人口以小麥作為主要食物。白粉病是影響小麥生產(chǎn)的重要病害，在氣候潮濕地區(qū)危害尤為嚴(yán)重，一般減產(chǎn)10％左右，嚴(yán)重年份達(dá)20-30％，培育高抗白粉菌的小麥品種是解決這一問題的根本途徑。小麥族內(nèi)的野生遺傳資源作為重要的基因庫，可以通過遺傳操作手段將它們中的有益基因?qū)肫胀ㄐ←溁蚱渌滎愖魑铮瑢υ耘喾N的改良具有重要的應(yīng)用價(jià)值。簇毛麥?zhǔn)切←湹慕壱吧N，蘊(yùn)藏著抗病、抗旱等大量有益基因，尤其對小麥白

2、粉病菌表現(xiàn)免疫，但目前對簇毛麥基因組的研究還不深入，不同來源的簇毛麥可能攜帶不同的抗性基因。
　　 小麥-簇毛麥6VS/6DL易位系Pm97033和Pm97034中的6VS染色體臂來自前蘇聯(lián)的簇毛麥No.1026，6VS/6AL易位系92R137中的6VS染色體臂源于英國劍橋植物園的簇毛麥H.v#2，但這2個(gè)易位系均具有來自簇毛麥良好的白粉病抗性。前人通過RFLP和RAPD分析，發(fā)現(xiàn)這2個(gè)不同來源的簇毛麥染色體臂6VS上存在多態(tài)

3、性。為了鑒定這2個(gè)材料中抗病基因的異同和探討其抗病機(jī)制，以與Pm21抗白粉病相關(guān)的關(guān)鍵基因絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶基因Stpk-V(GenBank編號：HQ864471.1)的基因組序列和cDNA序列為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)引物，從簇毛麥No.1026中克隆其同源基因，對不同簇毛麥來源的Stpk-V和小麥內(nèi)源基因序列進(jìn)行了結(jié)構(gòu)比對分析、生物信息學(xué)分析、拷貝數(shù)分析、表達(dá)特性分析、分子標(biāo)記開發(fā)和轉(zhuǎn)基因研究，取得了以下主要結(jié)果：
　　 (1)從簇毛麥

4、No.1026中分離了2個(gè)絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶基因(Stpk-V2和Stpk-V3)，序列比對發(fā)現(xiàn)，二者與Stpk-V基因組序列有很高的同源性，且Stpk-V3的編碼區(qū)與Stpk-V完全一致主要差異在于第4內(nèi)含子二者分別有22bp與84bp的片段插入。
　　 (2)基于Stpk-V2和Stpk-V3的堿基差異，采用等位基因特異性PCR(Allele-Specific PCR，AS-PCR)設(shè)計(jì)了一對錯配引物，將Stpk-V2定

5、位在了非6VS染色體臂上。
　　 (3)根據(jù)上述三條序列的堿基差異，開發(fā)了2個(gè)鑒別抗病品種的功能標(biāo)記。進(jìn)一步利用開發(fā)的標(biāo)記鑒定了抗白粉病品系CB037的抗性來源，鑒定結(jié)果與前人所用標(biāo)記的鑒定結(jié)果一致。
　　 (4)生物信息學(xué)分析表明，Stpk-V2基因編碼一個(gè)沒有信號肽的非分泌型蛋白，N端處有一跨膜區(qū)，在第52-74個(gè)氨基酸有ATP結(jié)合位點(diǎn)，在168-180氨基酸存在激酶活性位點(diǎn)。N-糖基化位點(diǎn)預(yù)測表明，Stpk-V2存

6、在5個(gè)糖基化位點(diǎn)。根據(jù)其編碼序列的保守區(qū)域，構(gòu)建了原核表達(dá)載體并進(jìn)行了原核表達(dá)，表達(dá)的目的蛋白大小(約33kD)與預(yù)期一致。
　　 (5)對Stpk-V2可能的啟動子區(qū)進(jìn)行了擴(kuò)增，并且利用D基因組與四倍體小麥A、B基因組間的染色體代換系以及小麥中國春第6同源群缺體/四體系對小麥絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶的啟動子進(jìn)行了擴(kuò)增，表明普通小麥6A、6B、6D染色體上各存在至少一個(gè)拷貝的同源基因，而6B、6D上相應(yīng)的啟動子區(qū)存在一個(gè)78bp的

7、序列刪除。
　　 (6)利用半定量PCR與實(shí)時(shí)定量PCR分析了Stpk-V、Stpk-V3分別在易位系92R137、Pm97034對白粉菌侵染的應(yīng)答反應(yīng)，表明在不同易位系中這兩個(gè)基因應(yīng)答模式稍有不同，差異的原因有待進(jìn)一步研究。
　　 (7)構(gòu)建了Stpk-V3基因的RNAi表達(dá)載體，分別以Pm97034成熟胚和幼胚為外植體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法和基因槍介導(dǎo)法進(jìn)行了轉(zhuǎn)化。對候選轉(zhuǎn)基植株進(jìn)行了PCR檢測，發(fā)現(xiàn)其中1株含目的基因片