簇毛麥抗白粉病基因StpK-V及其直系同源基因啟動子的克隆和特征分析.pdf

1、由專性寄生真菌小麥白粉病菌(Blumeriagraminisf.sp.tritici)引起的小麥白粉病是世界上許多國家小麥生產中危害日趨嚴重的病害之一，來自于小麥近緣物種簇毛麥的抗白粉病基因Pm21對白粉病抗性強、抗譜廣，已經(jīng)作為我國小麥抗白粉病育種的新一代抗源被廣泛利用。本實驗室曹愛忠等(2006)通過基因芯片雜交技術篩選到一個白粉菌誘導后上調表達的抗病相關基因Stpk-Ⅴ，并獲得了它的全長cDNA序列。把該基因轉入感病小麥可提高其抗

2、病性，推測Stpk-Ⅴ基因可能是Pm21位點的重要組成部分。雖然在普通小麥揚麥158中存在stpk-Ⅴ的直系同源基因Ta-A-Stpk，Ta-B-Stpk，Ta-D-Stpk，但該品種沒有表現(xiàn)出對白粉病抗性的原因仍然未知。為了進一步研究基因stpk-Ⅴ和直系同源基因在抗白粉病功能上的差異，本研究開展了對基因的啟動子扣基因功能分析兩個方面的工作:
　　1、將胡佳夢(2010)從普通小麥cDNA中克隆得到的stpk-Ⅴ的同源基因Ta-

3、D-Stpk構建超表達載體，利用基因槍轉化法將Ta-D-Stpk轉到感病小麥揚麥158中，進行功能互補實驗，驗證Ta-D-Stpk基因是否具有抗白粉病功能;
　　2、根據(jù)Stpk-Ⅴ啟動子的序列設計引物，利用同源克隆法克隆Stpk-Ⅴ及其在普通小麥A、B、D三個基因組中直系同源基因的啟動子，將這些啟動子分別命名為pStpk-Ⅴ，pTa-A-Stpk，pTa-B-Stpk和pTa-D-Stpk。將這些啟動子分別置于GFP之前，融合載

4、體分別命名為pSGFP-pStpk-Ⅴ,pSGFP-pTa-A-Stpk,pSGFP-pTa-B-Stpk,pSGFP-pTa-D-Stpk,利用瞬間表達方法檢測這些啟動子是否具有組成型表達活性。同時，將這些啟動子置于GUS之前，融合載體分別命名為pAHC25-pBI220-pStpk-Ⅴ，pAHC25-pBI220-pTa-A-Stpk,pAHC25-pBI220-pTa-B-Stpk,pAHC25-pBI220-pTa-D-Stpk

5、,利用瞬間表達方法檢測這些啟動子是否具有白粉菌誘導表達活性，檢測是否是啟動子的差異造成簇毛麥基因與普通小麥直系同源基因在白粉病抗性上的差異。
　　實驗結果表明:
　　1、在轉化了pSGFP的陽性對照葉片上，有大量GFP表達細胞，而轉化了pSGFP-pStpk-Ⅴ，pSGFP-pTa-A-Stpk，pSGFP-pTa-B-tpK和pSGFP-pTa-D-Stpk的葉片上，僅有個別細胞中有GFP基因表達，且信號微弱，所以pStp

6、k-Ⅴ，pTa-A-Stpk，pTa-B-Stpk和pTa-D-Stpk不具有組成型啟動子特征，是非組成型啟動子。
　　2、分別轉化pAHC25-pBI220-pStpk-Ⅴ，pAHC25-pBI220-pTa-A-Stpk，pAHC25-pBI220-pTa-B-Stpk和pAHC25-pBI220-pTa-D-Stpk四種表達載體的揚麥158葉片表皮，在未接種白粉菌的葉片上觀察不到GUS基因表達的細胞，然而接種白粉菌的葉片上都

7、能夠觀察到有GUS表達的細胞，并且在轉化pAHC25-pStpk-Ⅴ表達載體的葉片中觀察到的GUS細胞數(shù)目比轉化pAHC25-pBI220-pTa-A-Stpk，pAHC25-pBI220-pTa-B-Stpk，pAHC25-pBI220-pTa-D-Stpk表達載體的葉片中觀察到的GUS細胞數(shù)目多，由此推測簇毛麥Stpk-Ⅴ基因的啟動子pStpk-V和普通小麥揚麥158Stpk基因的啟動子pTa-A-Stpk，pTa-B-Stpk和p