Salmonella enterica中心代謝關(guān)鍵酶的賴氨酸可逆乙酰化修飾研究.pdf

1、蛋白質(zhì)翻譯后修飾是表觀遺傳學的重要內(nèi)容,賴氨酸可逆乙?；揎椨捎谕M蛋白修飾、熱量限制、細胞凋亡、壽命延長和轉(zhuǎn)錄沉默等生理過程密切相關(guān)逐漸成為人們研究的熱點。近年來,有關(guān)真核生物的乙?；{(diào)控研究成果日新月異,而原核生物的乙?；{(diào)控研究由于手段的缺乏和基礎(chǔ)的薄弱幾乎是處于停滯不前的狀態(tài)。
　　本論文利用賴氨酸乙酰化抗體的特異性,結(jié)合免疫沉淀和質(zhì)譜技術(shù)的高效分離特性,首次對原核生物Salmonellaenterica的乙?；孜锏鞍走M

2、行了蛋白組學水平的掃描,揭示乙?；揎椗c各種代謝關(guān)系密切;以可發(fā)酵碳源葡萄糖和不可發(fā)酵碳源檸檬酸為碳源,研究乙?；揎椗c不同代謝途徑之間的關(guān)系,并且從表型、生化和遺傳三個水平深入研究了乙?；揎棇.enterica中心代謝的調(diào)控機制,首次揭示賴氨酸可逆乙酰化修飾是中心代謝在整體水平上的一種調(diào)控方式;同時結(jié)合我們合作實驗室關(guān)于真核生物乙酰化修飾的研究結(jié)果,提出賴氨酸可逆乙?；揎検且环N廣泛存在于真核和原核生物中的非常保守的中心代謝的調(diào)控

3、機制。
　　整個研究分為以下四個部分展開。
　　第一部分我們利用免疫沉淀的高靈敏性富集賴氨酸乙?；亩?并利用質(zhì)譜技術(shù)的高分辨率,首次對原核生物S.enterica的賴氨酸乙酰化修飾底物蛋白在蛋白組學水平上進行了掃描研究,得到一系列與能量代謝、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、氨基酸和核酸合成等密切相關(guān)的乙酰化修飾底物蛋白。本試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)有166個蛋白的190個肽段是乙?；?且其中的77個蛋白是與代謝相關(guān)的,這大大超出了我們對乙酰化修飾的預期,為

4、原核生物的乙?；芯块_辟了一個新的天地。
　　第二部分我們采用Red重組技術(shù)成功獲得了S.enterica的乙?；D(zhuǎn)移酶(Pat)和/或去乙?；?CobB)缺失的突變株,并對它們在葡萄糖和檸檬酸為唯一碳源的基本培養(yǎng)基上的生長表型進行了研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn)S.enterica及其衍生菌株在不同碳源基本培養(yǎng)基中展示出截然不同的生長表型,確認了乙?；揎椗cS.enterica能量代謝之間的密切關(guān)系,并提出乙?；D(zhuǎn)移酶(Pat)和去乙?；?

5、Cobb)可能是目前唯一已知的能夠?qū).enterica中心代謝關(guān)鍵酶起可逆乙?；揎椪{(diào)控的乙?；揎椕?。
　　第三部分我們克隆并表達了乙?；D(zhuǎn)移酶(Pat)和去乙?；?CobB)以及中心代謝關(guān)鍵酶,如3-磷酸甘油醛脫氫酶(GapA)、異檸檬酸脫氫酶激酶,磷酸化酶(AceK)和異檸檬酸裂解酶(AceA),并在體外重構(gòu)Pat/CobB介導的乙?；?去乙?；揎楏w系,研究乙?；揎棇@些酶活性的調(diào)控方式;同時構(gòu)建GapA、AceK和

6、AeeA乙酰化修飾位點的點突變蛋白和敲除突變株,體外測定酶活力變化,研究這三個酶的具體乙?；揎椢稽c,并進行表型互補試驗。結(jié)果發(fā)現(xiàn)GapA的脫氫酶活力與乙?；揎椪嚓P(guān),而AceK的激酶活力和AceA裂解酶活力與乙?；揎椮撓嚓P(guān),且GapA的第108、115、321和331位賴氨酸,AceK的第72、83和553位賴氨酸,AceA的第13和308位賴氨酸與乙?；揎椕芮邢嚓P(guān)。
　　第四部分我們以核糖體RNA16SrRNA為內(nèi)參基因

7、,利用定量熒光實時PCR研究乙酰基轉(zhuǎn)移酶(Pat)和去乙?；?CobB)的轉(zhuǎn)錄與不同代謝途徑乙?；揎椫g的關(guān)系,結(jié)果顯示:在葡萄糖為碳源的情況下,pat和cobB的轉(zhuǎn)錄水平要高于檸檬酸為碳源;不管是葡萄糖還是以檸檬酸為碳源,對數(shù)期pat和cobB的轉(zhuǎn)錄水平均要高于它們在穩(wěn)定期和遲滯期的轉(zhuǎn)錄水平;提出存在一個乙?；瘽撃?patmRNA/cobBmRNA)的概念,即pat和cobb的轉(zhuǎn)錄水平?jīng)Q定了不同時期的乙?；揎椝健Ｍㄟ^qRT-P

8、CR試驗,在轉(zhuǎn)錄水平驗證了乙?；揎椗c不同碳源代謝之間的相互關(guān)系。
　　綜上所述,本論文綜合乙?；揎椩谏?、生化和遺傳三個方面的證據(jù),驗證了乙?；揎検且环N廣泛存在于原核生物S.enterica中的調(diào)控方式;提出S.Enterica不同代謝通路轉(zhuǎn)換的分子機制是通過乙?；D(zhuǎn)移酶(Pat)和去乙?；?CobB)的共同作用,對中心代謝關(guān)鍵酶類如GapA,AceA和AceK等進行可逆的乙?；揎?從整體水平上調(diào)控中心代謝;結(jié)合我們合作