雙孢蘑菇褐變相關PPO基因的克隆及表達分析.pdf

1、多酚氧化酶是催化褐變的關鍵酶，而褐變是雙孢蘑菇采后對商品品質影響最大的品質劣變之一?？寺‰p孢蘑菇褐變相關基因，是實現(xiàn)蘑菇抗褐變定向育種的一項重要的基礎研究工作。本研究用雙孢蘑菇2796為試樣，采用RT-PCR、RACE法克隆了來自于雙孢蘑菇子實體褐化相關的PPO基因，并使其在大腸桿菌中做表達。對其基因進行同源性比較和序列分析。論文包括了三部分實驗：
　　 (1)雙孢蘑菇多酚氧化酶PPO基因的克隆及氨基酸序列測定：設計codeho

2、p引物克隆了PPO基因cDNA片段，并根據(jù)獲得的序列信息，用cDNA末端快速擴增(RACE)方法從雙孢蘑菇中克隆到了兩個PPO同源基因的cDNA全長，將其命名為AbPPO3和AbPPO4，核酸長度分別為1.88kb和2.023kb，分別編碼576和611個氨基酸，具有多酚氧化酶的Cu結合保守結構域。同源性分析表明，AbPPO3編碼的氨基酸序列與其他真菌PPO同源蛋白的相似性約為21-50％;AbPPO4與其他真菌PPO蛋白的相似性約為2

3、0-63%。系統(tǒng)進化分析表明，AbPPO3和AbPPO4和已克隆的雙孢蘑菇AbPPO2具有較近的進化關系。
　　 (2)多酚氧化酶基因表達的半定量RT-PCR分析：用半定量RT-PCR法，以18srRNA基因作為內(nèi)參照，研究雙孢蘑菇褐變相關基因PPOmRNA的表達水平。分析結果表明，在雙孢蘑菇子實體的不同發(fā)育時期，AbPPO3在針頭期(pin head stage)表達量很低，在茶杯期(cup stage)至大開傘期(flat2

4、 stage)表達量均較高。AbPPO4在針頭期(pin head stage)到大開傘期（flat2 stage）表達量逐漸增強。雙孢蘑菇4℃儲藏時，AbPPO3和AbPPO4在第1天可檢測到微量表達，第2～4天表達均較強，之后至第7天表達量下降。
　　 (3)多酚氧化酶PPO基因在大腸桿菌中的表達：將PPO構建到pET28a(+)上，轉入E.coliBL21(DE3)獲得重組菌株，使用異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)