PPO基因表達分析及雙孢蘑菇高效表達載體的構建.pdf

1、多酚氧化酶(PolyphenolOxidase，PPO)是引起雙孢蘑菇(Agaricusbisporus)褐變的關鍵酶，研究雙孢蘑菇不同生長時期以及不同處理條件下PPO基因的表達情況是進一步研究PPO基因活性的基礎。構建合適的雙孢蘑菇遺傳轉化體系、提高轉化率，為從分子水平上研究PPO基因以及雙孢蘑菇其他功能基因提供有利工具，對雙孢蘑菇遺傳育種有著重要意義。本文研究了雙孢蘑菇不同發(fā)育時期、不同處理下PPO基因表達的活性，建立了雙孢蘑菇的高

2、效轉基因體系，并構建了雙孢蘑菇PPO基因啟動子的表達載體。
　　 以雙孢蘑菇不同發(fā)育時期的子實體以及采后的雙孢蘑菇在4℃貯藏條件下取樣，提取雙孢蘑菇的總RNA，并以18SrRNA為參照，利用半定量RT-PCR技術，對不同采樣的雙孢蘑菇中PPO基因mRNA的表達情況進行分析。雙孢蘑菇中已克隆出的四種PPO基因即AbPPO1、AbPPO2、AbPPO3、AbPPO4，在雙孢蘑菇發(fā)育的各個時期中表達情況分別為AbPPO1在雙孢蘑菇各發(fā)

3、育階段表達情況基本一致，AbPPO2在發(fā)育中期較高，AbPPO3在成熟期較高，AbPPO4表達量逐漸增強。在4℃貯藏條件下，AbPPO1和AbPPO2表達量無明顯變化，AbPPO3和AbPPO4隨著貯藏時間的延長，先增加后減弱。
　　 克隆雙孢蘑菇gpd強啟動子，并利用gpd強啟動子，置換植物雙元表達載體pCambia1301中自帶的花椰菜花葉病毒(CaMV)35S啟動子，構建適用于雙孢蘑菇轉化的表達載體pCghg，并導入農(nóng)桿菌

4、中。通過研究不同轉化條件下的轉化效率，建立農(nóng)桿菌介導的雙孢蘑菇的高效轉基因體系。結果表明，在農(nóng)桿菌侵染菌液濃度OD600nm為0.05、侵染時間30min、預培養(yǎng)時乙酰丁香酮(Acetosyringone，AS)濃度為200μmol、共培養(yǎng)24h的條件下，轉化效率最高，可達70％以上。
　　 根據(jù)雙孢蘑菇PPO3序列，設計特異引物，克隆雙孢蘑菇PPO3啟動子，并置換表達載體pCambia1301中CaMV35S啟動子構建表達載體