高效雙價(jià)(Bt+cpti)植物表達(dá)載體的構(gòu)建及其在棉花中的表達(dá)分析.pdf

1、棉鈴蟲的持續(xù)性爆發(fā)給棉花生產(chǎn)造成了災(zāi)難性的損失,如何有效防治蟲害一直是提高棉花產(chǎn)量面臨的一個(gè)巨大問(wèn)題。20世紀(jì)90年代,人們通過(guò)生物工程手段將抗蟲基因構(gòu)建到合適的植物表達(dá)載體上,并轉(zhuǎn)化棉花獲得轉(zhuǎn)基因抗蟲棉。如中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所郭三堆研究員課題組先后獲得了單價(jià)Bt抗蟲棉和雙價(jià)Bt、cpti抗蟲棉,不但減少了農(nóng)藥使用量,提高了棉農(nóng)的經(jīng)濟(jì)效益,而且對(duì)環(huán)境無(wú)污染,大大提高了棉花的抗蟲性,在生產(chǎn)上得到了廣泛的推廣。
　　然而,隨著

2、抗蟲棉的大面積種植,不論是單價(jià)還是雙價(jià),種植一定年限后,害蟲也會(huì)對(duì)其產(chǎn)生相應(yīng)的抗性或者耐受性,使得農(nóng)業(yè)生物技術(shù)再次面臨嚴(yán)峻的考驗(yàn)。針對(duì)這種情況,有人在待表達(dá)外源基因的兩端加上信號(hào)肽序列,通過(guò)外源基因在植物體內(nèi)的定向運(yùn)輸而提高外源基因在植物體內(nèi)的積累量。AlexanderSchouten等1996年將一個(gè)單鏈抗體(scFv)的C端增加了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號(hào)肽(KDEL)序列,結(jié)果顯示帶有信號(hào)肽的基因其蛋白表達(dá)量提高了近1％?；谶@種情況,本論文

3、開展了如下研究:
　　1.以實(shí)驗(yàn)室已有的雙價(jià)基因?yàn)榛A(chǔ),在cpti基因的5’端增加了大豆胰蛋白酶抑制劑(SKTI)信號(hào)肽序列,而在其3’端增加了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號(hào)肽(KDEL)序列,同時(shí)在Bt基因的5’端增加了葉綠體靶向肽序列,最終構(gòu)建了含有信號(hào)肽序列的雙價(jià)表達(dá)載體;
　　2.通過(guò)southern雜交分析了外源基因在受體植株中的拷貝數(shù)。結(jié)果表明,外源基因分別以不同的拷貝數(shù)整合到了受體植物中;
　　3.通過(guò)ELISA分析了外

4、源基因在受體植株中的積累情況。結(jié)果表明,Bt蛋白的積累量提高了1-8倍,而CpTI蛋白的積累量也提高了1倍左右,推測(cè)可能與cpti自身表達(dá)量以及抗原抗體的結(jié)合能力和ELISA操作過(guò)程有關(guān);
　　4.通過(guò)接蟲實(shí)驗(yàn)分析了轉(zhuǎn)基因植株的抗蟲性。結(jié)果表明,雙價(jià)轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株的葉片面積受損程度較低,且棉鈴蟲已致死;而對(duì)照葉片面積受損嚴(yán)重,棉鈴蟲仍然存活,且體積明顯增大;單價(jià)Bt轉(zhuǎn)基因植株的葉片面積受損也較為嚴(yán)重,但四天后棉鈴蟲還是致死;Bt單

5、價(jià)的嚴(yán)重?fù)p傷說(shuō)明棉鈴蟲確實(shí)產(chǎn)生了一定的抗性,而修飾的雙價(jià)抗蟲效果則明顯增強(qiáng)。說(shuō)明添加信號(hào)肽的高效植物表達(dá)載體提高了轉(zhuǎn)基因棉花的抗蟲性。
　　本研究構(gòu)建了含有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號(hào)肽序列、大豆胰蛋白酶抑制劑信號(hào)肽序列以及葉綠體靶向肽序列的雙價(jià)表達(dá)載體,并以恢復(fù)系Y18為受體進(jìn)行轉(zhuǎn)化,對(duì)獲得的轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行了Southern雜交、ELISA以及抗蟲性分析,為獲得更高抗性的雙價(jià)轉(zhuǎn)基因抗蟲棉以及基因工程中其它植物蛋白積累量的提高提供了一種新的方法