鷹嘴豆孢克魯維酵母分泌表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建及菊粉酶的高效分泌表達(dá).pdf

1、建立一種高效酵母分泌表達(dá)系統(tǒng)對(duì)利用酵母生產(chǎn)異源蛋白是十分重要的。在已經(jīng)建成鷹嘴豆孢克魯維酵母CBS4857宿主Y179U，載體pUK1、pUKD和pUKD-S的基礎(chǔ)上，利用克魯維酵母菊粉酶基因啟動(dòng)子和終止子作為表達(dá)元件，采用釀酒酵母的α因子信號(hào)肽作為分泌信號(hào)，并以人α-2a干擾素作為試驗(yàn)基因構(gòu)建了表達(dá)質(zhì)粒pUK1-PIT、pUKD-PIT和pUKD-S-PIT。轉(zhuǎn)化子Y179U/pUK1-PIT，Y179U/pUKD-PIT和Y179U

2、/pUKD-S-PIT成功地分泌表達(dá)了人α-2a干擾素，其中轉(zhuǎn)化子Y179U/pUKD-S-PIT具有最高的干擾素表達(dá)水平，每毫升發(fā)酵上清液可分泌表達(dá)干擾素1.3×106IU；經(jīng)過(guò)對(duì)培養(yǎng)條件的初步優(yōu)化，在搖瓶培養(yǎng)條件下干擾素分泌表達(dá)量可達(dá)到60mg/L以上。 考慮到菊粉酶信號(hào)肽能夠在克魯維酵母中有效指導(dǎo)大量的菊粉酶分泌，文獻(xiàn)也曾報(bào)導(dǎo)該信號(hào)肽能夠指導(dǎo)異源蛋白分泌表達(dá)，我們?cè)谔烊痪辗勖感盘?hào)肽編碼序列的基礎(chǔ)上，通過(guò)引入無(wú)義突變(將編碼

3、纈氨酸的密碼子GTT突變?yōu)镚TG)，從而得到引入限制性酶切位點(diǎn)BclI的菊粉酶信號(hào)肽；在此基礎(chǔ)上利用pUKD-S載體和克魯維酵母菊粉酶基因啟動(dòng)子、終止子表達(dá)元件構(gòu)建了干擾素分泌表達(dá)質(zhì)粒pUKD-SI-PIT；該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化鷹嘴豆孢克魯維酵母Y179U后，轉(zhuǎn)化子也成功地分泌表達(dá)了干擾素，但是表達(dá)量低于采用α因子信號(hào)肽指導(dǎo)分泌表達(dá)的轉(zhuǎn)化子；利用上述兩種信號(hào)肽的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到乳酸克魯維酵母Y166中得到了類似的結(jié)果。此外，在釀酒酵母和畢赤酵母中利

4、用改造的菊粉酶信號(hào)肽進(jìn)行了干擾素的分泌表達(dá)嘗試，但是均未能檢測(cè)到分泌表達(dá)的干擾素。 利用菊粉酶基因的啟動(dòng)子、終止子作為表達(dá)元件，分別利用α因子信號(hào)肽、天然的菊粉酶信號(hào)肽和改造的菊粉酶信號(hào)肽，以pUKD-S載體為基礎(chǔ)上構(gòu)建了三種菊粉酶分泌表達(dá)質(zhì)粒：pUKD-S-αF-PInuT、pUKD-S-CSS-PInuT和pUKD-SI-PInuT，將這三種表達(dá)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化鷹嘴豆孢克魯維酵母Y179U和乳酸克魯維酵母Y166，轉(zhuǎn)化子都能夠有

5、效地大量分泌表達(dá)菊粉酶，其中帶有兩種菊粉酶信號(hào)肽的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子在分泌表達(dá)菊粉酶的能力上明顯優(yōu)于帶有α因子信號(hào)肽表達(dá)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子；鷹嘴豆孢克魯維酵母轉(zhuǎn)化子表達(dá)菊粉酶的量明顯高于乳酸克魯維酵母。與此同時(shí)，以pHC11和pPIC9K為基礎(chǔ)也同樣利用不同的信號(hào)肽分別構(gòu)建了用于轉(zhuǎn)化釀酒酵母和畢赤酵母的各三種菊粉酶分泌表達(dá)質(zhì)粒：pHC-αF-PInuT、pHC-I-PInuT、pHC-CSS-PInuT和pPIC9K-αF-PinuT、pPIC9

6、K-CSS-PinuT、pPIC9K-BJ-PinuT。上述兩組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化釀酒酵母DCO4和畢赤酵母GS115和SMD1168后，實(shí)驗(yàn)證實(shí)釀酒酵母轉(zhuǎn)化子只分泌表達(dá)少量菊粉酶，而畢赤酵母轉(zhuǎn)化子則能大量分泌表達(dá)菊粉酶，與鷹嘴豆孢克魯維酵母轉(zhuǎn)化子分泌表達(dá)水平相當(dāng)，每升發(fā)酵液中菊粉酶都可達(dá)克級(jí)水平。進(jìn)一步的分析表明在克魯維酵母和畢赤酵母中分泌表達(dá)的菊粉酶與天然表達(dá)的菊粉酶糖基化型式相同，均為N-糖基化。 利用KcURA3基因片斷，對(duì)Y

7、179U進(jìn)行HIS3基因中斷，得到了his3突變株Y179H。Y179H在生長(zhǎng)性狀上優(yōu)于Y179U。以Y179H為宿主菌也成功地分泌表達(dá)了人α-2a干擾素和菊粉酶，但表達(dá)水平?jīng)]有進(jìn)一步提高。 總之，通過(guò)本研究我們可以得出以下結(jié)論：1.我們建立的鷹嘴豆孢克魯維酵母分泌表達(dá)系統(tǒng)，已經(jīng)成功地分泌表達(dá)了人α2a干擾素和菊粉酶，其表達(dá)量已經(jīng)達(dá)到很高的水平。因此，鷹嘴豆孢克魯維酵母分泌表達(dá)系統(tǒng)可以認(rèn)為是一個(gè)有潛力的基因工程表達(dá)系統(tǒng)。