鷹嘴豆孢克魯維酵母菊粉酶的分泌表達(dá)與應(yīng)用研究.pdf

1、通過轉(zhuǎn)入菊粉酶基因表達(dá)質(zhì)粒pUKD-S-αF-PinuT，成功地構(gòu)建了分泌表達(dá)菊粉酶的重組乳酸克魯維酵母(Kluyveromyces lactis)，菊粉酶基因來源于鷹嘴豆孢克魯維酵母(Kluyveromyces cicerisporus CBS4857，Y179)。研究發(fā)現(xiàn)Klhap1基因的突變能促進(jìn)外源菊粉酶的分泌表達(dá)。發(fā)酵120h時，Klhap1△重組酵母發(fā)酵液酶活達(dá)到391 U/ml，是野生型重組酵母的2.2倍。熒光定量PCR數(shù)

2、據(jù)顯示Klhap1△重組酵母中的Kcinu mRNA水平明顯比野生型重組酵母中的高。在非選擇性培養(yǎng)基中生長50世代時，具有菊粉酶表達(dá)質(zhì)粒的細(xì)胞在Klhap1△重組酵母和野生型重組酵母中比例分別達(dá)到99％、89％。以上結(jié)果說明，Klhap1基因的突變有利于菊粉酶在乳酸克魯維酵母中更穩(wěn)定、更高水平的表達(dá)。
　　利用同源重組技術(shù)成功構(gòu)建了hap1基因缺失突變的釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)Y16hap1△菌

3、株，以lacZ為報告基因測定了不同啟動子在Y16及Y16hap1△菌株中啟動轉(zhuǎn)錄的效率，短型菊粉酶基因啟動子PinuS與釀酒酵母翻譯延伸因子基因啟動子Ptef引導(dǎo)的β-半乳糖苷酶活性最高，長型菊粉酶基因啟動子PinuL在Y16hap1△菌株中的轉(zhuǎn)錄效率比在Y16中的要低，這與乳酸克魯維酵母中的結(jié)果相反，提示Klhap1基因與Schap1基因的功能有差異。
　　上述研究使我們對鷹嘴豆孢克魯維酵母菊粉酶基因在乳酸克魯維酵母和釀酒酵母中

4、外源表達(dá)的性質(zhì)有更深入的了解，有助于酵母表達(dá)系統(tǒng)的開發(fā)與利用。提示了可以利用Klhap1△乳酸克魯維酵母更高效地表達(dá)其他目的外源蛋白。
　　構(gòu)建了四種利用附加型載體表達(dá)菊粉酶的重組釀酒酵母，其中Y16/pHC-PinuLT分泌的菊粉酶酶活最高，發(fā)酵96h時達(dá)到最高(57U/ml)，是Y16hap1△/pHC-PinuLT菌株產(chǎn)生的菊粉酶酶活的2倍。說明Schap1基因的突變降低了外源菊粉酶基因的表達(dá)。在菊芋培養(yǎng)液中發(fā)酵Y16/pH