瘤背石磺內(nèi)參基因篩選和皮膚發(fā)育相關(guān)基因EGF和IF的克隆與表達分析.pdf

1、瘤背石磺（Onchidium struma）是生活于灘涂濕地的半咸水兩棲性生物，隸屬于軟體動物門（Mollusca）、腹足綱（Gastropoda）、肺螺亞綱（Pulmonata）、縮眼目（Systellommatophora）、石磺科（Onchidiidae），是一種具有很高的食用和藥用價值的貝類。其生活區(qū)域常見于中國的江蘇省、上海市、浙江省、福建省、廣東省等地的淡水與海水交匯處的高潮帶，其溫度適應(yīng)能力強、分布范圍廣、野生資源量非常豐

2、富。目前國內(nèi)外學(xué)者對于石磺的研究工作主要集中在系統(tǒng)分類學(xué)、生物學(xué)形態(tài)特征、營養(yǎng)價值評定、胚胎發(fā)育和繁殖機制以及活性物質(zhì)的分離提取等方面。
　　表皮生長因子可促進上皮細(xì)胞的增殖發(fā)育，中間絲蛋白在維持細(xì)胞形態(tài)上發(fā)揮重要作用，內(nèi)參基因的篩選是進行基因定量分析的前提條件。石磺科的蛻皮現(xiàn)象涉及到上皮細(xì)胞的大量更新，其運動能力則與肌肉細(xì)胞的形變程度有聯(lián)系。本文對瘤背石磺進行了內(nèi)參基因的初步篩選，初步探討功能基因EGF和IF的理化結(jié)構(gòu)和進化關(guān)系

3、，并針對兩基因在石磺蛻皮與否和運動能力強弱上進行了較為深入的分析，希望能為研究瘤背石磺生物學(xué)類兩棲特性相關(guān)的功能基因積累資料。
　　1．依托瘤背石磺轉(zhuǎn)錄組分析數(shù)據(jù)庫，挑選出7個常用內(nèi)參基因的序列作為候選基因，經(jīng)NCBI上BLAST比對及初步鑒定后，設(shè)計熒光定量PCR引物，統(tǒng)計分析各候選基因在瘤背石磺不同組織中表達的穩(wěn)定性。BestKeeper軟件分析顯示其穩(wěn)定性大小為：EF1α＞TUBB＞RPL28＞Ubiq＞18SrRNA=CY

4、C＞ACTB；在geNorm軟件的分析結(jié)果里，穩(wěn)定性的大小為：EF1α＞RPL28＞CYC＞Ubiq＞TUBB＞18S rRNA＞ACTB；而Normfinder軟件給出的穩(wěn)定值排序為：EF1α＞RPL28＞Ubiq＞CYC＞TUBB＞18SRNA＞ACTB。常用內(nèi)參基因的ACTB的標(biāo)準(zhǔn)差（SD）最大，其表達穩(wěn)定性在7個候選基因中最低，穩(wěn)定性最高的候選基因為EF1α。在瘤背石磺的不同組織表達分析時篩選出最適合內(nèi)參基因為EF1α，而由No

5、rmfinder軟件給出的最優(yōu)內(nèi)參基因組合為EF1α和RPL28。
　　2．從瘤背石磺背部皮膚組織中克隆得到了瘤背石磺表皮生長因子（Os-egf1）基因，并進行序列分析、結(jié)構(gòu)預(yù)測和組織表達水平測定。利用RACE克隆技術(shù)所獲得的Os-egf1基因的cDNA序列全長為1158bp，其開放閱讀框（ORF）長度為846bp，并編碼一條長為281個氨基酸殘基的多肽鏈；沒有明顯的信號肽，分子量為30.51kDa，該基因存在一個跨膜結(jié)構(gòu)域（膜內(nèi)

6、1-16aa,膜上17-39aa，膜外40-281aa），亞細(xì)胞定位發(fā)現(xiàn)該多肽位于細(xì)胞核內(nèi)，理論等電點（PI）是5.41，為一個偏酸性的蛋白。有6個Ser、3個Thr、3個Tyr可能為蛋白激酶磷酸化作用的位點。Os-egf1氨基酸的序列中半胱氨酸（Cys）殘基明顯較多，占氨基酸殘基總數(shù)的11.40％，并不分布于多肽鏈的N端和C端，多集中于肽鏈的中段部分。半胱氨酸殘基主要分布在對應(yīng)的三個EGF-like的結(jié)構(gòu)域里，且結(jié)構(gòu)域中至少6個半胱氨

7、酸殘基參與形成CX7 CX4-5 CX10-13 CXCX8 C的類似結(jié)構(gòu)，推測其相互之間形成的3對二硫鍵為維持結(jié)構(gòu)域特定的空間結(jié)構(gòu)所必需。除去結(jié)構(gòu)域中的半胱氨酸殘基，該基因的序列保守性非常低，進化樹結(jié)果顯示EGF家族中不同成員各自聚為一支。瘤背石磺不同組織的相對定量分析顯示 Os-egf1高表達于背部皮膚，表皮生長因子可促進上皮細(xì)胞的增殖分裂，初步推測Os-egf1基因與瘤背石磺蛻皮現(xiàn)象明顯與否有關(guān)。
　　3．從瘤背石磺背部皮膚

8、組織中克隆了瘤背石磺中間絲蛋白（Os-IF1）基因，序列拼接結(jié)果顯示，所克隆得到的Os-IF1基因的cDNA核酸序列全長為1957bp，其開放閱讀框長度為1359bp，并編碼一條長為452個氨基酸殘基的多肽鏈。沒有明顯的信號肽，分子量為51.54kDa，不存在跨膜結(jié)構(gòu)域，亞細(xì)胞定位發(fā)現(xiàn)該多肽位于細(xì)胞核內(nèi)，理論等電點為5.21，為一個偏酸性的蛋白，含有23個Ser、14個Thr、6個Tyr蛋白激酶磷酸化位點。Os-IF1預(yù)測的氨基酸序列中

9、，以α螺旋為主，占據(jù)整條多肽鏈的82%，符合中間絲蛋白的典型特征。氨基酸序列的同源性比對發(fā)現(xiàn)其與中間絲蛋白家族成員的序列同源性較高。在相對定量表達分析中，Os-IF1在瘤背石磺中表達量較高的為前觸角和腹足兩個組織，而其他三種石磺表達量最高的組織均為腹足，推測該基因產(chǎn)物與石磺運動過程中腹足肌肉的收縮有關(guān)。不同種石磺之間的表達分析顯示，瘤背石磺中的表達量最高，具體原因有待于進一步的探究。序列比對中發(fā)現(xiàn)該基因的保守性非常高，而進化樹基本表現(xiàn)為