水貂和貉Toll樣受體基因的克隆及表達(dá)分析和貉外周血單個核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究.pdf

1、近年來，隨著毛皮動物飼養(yǎng)業(yè)的發(fā)展、飼養(yǎng)管理不當(dāng)和抗病力下降等原因，致使毛皮動物疫病在有些地區(qū)爆發(fā)，導(dǎo)致毛皮動物大規(guī)模的死亡。因此，深入了解并研究毛皮動物免疫防御機(jī)制，尋找提高機(jī)體抗病能力的有效方法，同時培育抗病品系，是毛皮動物養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展的必驅(qū)之勢。
　　本研究以雪貂TLRs基因為參考序列設(shè)計四對引物，從水貂PBMCs中擴(kuò)增TLR4、TLR6、TLR7及TLR8部分基因，分別進(jìn)行分子克隆并對所得序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，進(jìn)一步利用

2、半定量RT-PCR技術(shù)分析TLR4和TLR7基因mRNA在不同年齡水貂的各組織（肝臟、肺臟、肌肉、腎臟、小腸、脾臟）及PBMCs中的表達(dá)情況。結(jié)果表明，水貂TLRs與食肉目動物（雪貂、北極熊、大熊貓、海象、海豹、犬、老虎、貓）具有較高的同源性，在系統(tǒng)發(fā)育樹中距離最近;與禽類、魚同源性較低;TLR7基因在不同物種間具有較高的保守性，而TLR4基因的保守性最低。組織表達(dá)分析表明，TLR4和TLR7在檢測的組織中廣泛表達(dá)且表達(dá)量存在差異，相比

3、成年水貂，仔貂各組織中TLR4和TLR7基因表達(dá)量更高。
　　本研究系國內(nèi)首次利用RT-PCR和RACE技術(shù)，以犬TLR8基因為參考序列設(shè)計引物，克隆了貉TLR8基因全長序列，應(yīng)用生物信息學(xué)軟件分析該基因及預(yù)期編碼蛋白的特征。結(jié)果顯示該基因全長3199bp，ORF全長3114bp，編碼1038個氨基酸，含有Toll樣受體家族典型的結(jié)構(gòu)域特征。同源性分析顯示貉TLR8基因核苷酸序列與犬同源性最高，達(dá)99.3％;與其他食肉目哺乳動物也

4、有較高的同源性，在89.2％-92.9％之間:與魚類同源性最低，親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。
　　采用二代測序技術(shù)，對貉PBMCs轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了RNA-Seq測序、de novo拼接和信息比對研究。結(jié)果表明:轉(zhuǎn)錄組測序共得到了3.1GB的原始數(shù)據(jù)，共32245804個讀長，去除載體信息的數(shù)據(jù)量為28797350個讀長。經(jīng)質(zhì)量控制和de novo拼接后，對組裝出來的轉(zhuǎn)錄本利用TransDecoder鑒定coding區(qū)域，共獲得了118868條貉轉(zhuǎn)錄

5、本，其平均長度為525.53bp。利用Trinotate對ORF和contigs進(jìn)行功能注釋，用Uniprot database、RNAMMER、eggNOG、GO、KEGG對預(yù)測出來的序列進(jìn)行注釋，其中，COG功能注釋中信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制(T)及防御機(jī)理(V)，KEGG注釋通路中B/T-細(xì)胞受體信號通路、TLR/NLR/ RIR受體信號通路、吞噬體通路、自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性通路均與貉免疫應(yīng)答與抗病相關(guān)。
　　通過對水貂TLR4、