一個新的豬囊尾蚴蛋白的cDNA分子篩選、克隆、表達與鑒定.pdf

1、目的:應用免疫學方法篩選豬囊尾蚴cDNA文庫，以尋找新的編碼豬囊尾蚴病診斷抗原候選分子基因。 方法：采集豬囊尾蚴患者血清，用大腸桿菌裂解液吸附去除其中的大腸桿菌抗體；免疫學篩選豬囊尾蚴cDNA文庫;在2次復篩陽性的克隆中選取9個進行插入片斷的核苷酸序列測定，結(jié)果送GenBank進行同源性分析。根據(jù)序列測定結(jié)果，選取其中四個其完整開放閱讀框架的基因，設計合成引物，進行PCR擴增，并將其克隆入PMD-18T載體，然后再亞克隆至原核表

2、達載體PET28a(＋)中。經(jīng)IPTG誘導表達，進行SDS-PAGE分析和Western-blot鑒定。 結(jié)果：用抗血清初篩了約6.1×103個重組噬菌體，得到42個陽性克隆，對其中的18個克隆進行復篩，得到9個持續(xù)陽性反應克隆。選取其中有插入片段的4個重組噬菌體單克隆進行序列測定，獲得的序列經(jīng)GenBank進行同源性比較后發(fā)現(xiàn)4條序列均為未知的豬囊尾蚴序列，其中編號為5H克隆的插入序列與編碼日本血吸蟲核糖體樣蛋白的基因具高度同

3、源性，其具有一個528bp的完整開放閱讀框。PCR法擴增該基因，克隆入載體PMD-18T，再亞克隆入原核表達載體PET28a中，所形成的質(zhì)粒經(jīng)雙酶切和以質(zhì)粒為模板進行PCR擴增，均可獲得一條與PCR產(chǎn)物一致的DNA片段。IPTG誘導后進彳亍SDS-PAGE，發(fā)現(xiàn)在約24KDa位置出現(xiàn)一條表達條帶，且隨著表達時間的推移，表達產(chǎn)物量增大。Western-blot鑒定結(jié)果表明陽性病人的血清可特異性識別此條帶。 結(jié)論：從豬囊尾蚴cDNA