一個(gè)新的水稻類受體蛋白激酶OsRLK197的克隆與初步研究.pdf

1、水稻作為人們?nèi)粘Ｉ钪斜夭豢缮俚募Z食作物，全世界約1/2的人們都以其為主食，其基因功能的揭示對維護(hù)全世界糧食安全有重大的意義。植物類受體蛋白激酶(receptor-like protein kinase，RLKs)是植物中一類數(shù)量較多的基因家族，包含胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜區(qū)和胞內(nèi)激酶域三部分。植物細(xì)胞具有感受外界生物和非生物因子刺激的能力，并能通過細(xì)胞膜內(nèi)外信號傳導(dǎo)最終對胞外信號做出適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)。RLKs細(xì)胞內(nèi)的激酶結(jié)構(gòu)域通過自身磷酸化或者去磷

2、酸化的反應(yīng)，將胞外感知的信號傳遞至為胞內(nèi)，然后胞內(nèi)發(fā)生一系列的生理生化反應(yīng)以此響應(yīng)外界刺激。對植物RLKs的作用分析對植物抗病功能及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，研究植物對體內(nèi)、外刺激反應(yīng)的機(jī)理，發(fā)現(xiàn)植物感知體內(nèi)、外信號分子等有重要意義。隨著對其功能的逐步了解，RLKs已成為植物科學(xué)的研究熱點(diǎn)之一。特別是對該蛋白激酶家族在植物抗逆中的作用倍受關(guān)注。
　　OsRLK197屬于LRR-RLKs亞家族，本實(shí)驗(yàn)對其是否響應(yīng)激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以及生物與非生物脅迫

3、反應(yīng)進(jìn)行研究。主要結(jié)果如下:
　　(1)利用生物信息學(xué)分析確定OsRLK197具有l(wèi)eucine-rich repeats結(jié)構(gòu)域，OsRLK197具有跨膜結(jié)構(gòu)域，歸屬于LRR-RLKs亞家族。OsRLK197蛋白是一種親水性蛋白，無信號肽特征，預(yù)測其激酶域有29個(gè)磷酸化位點(diǎn)，可能發(fā)生磷酸化，進(jìn)而改變構(gòu)象傳遞信號。OsRLK197基因在水稻不同組織器官中均存在表達(dá)。通過生物信息學(xué)分析啟動子，發(fā)現(xiàn)OsRLK197基因有響應(yīng)ABA及逆境

4、脅迫的元件。
　　(2)用搜索序列設(shè)計(jì)OsRLK197特異性引物，成功克隆OsRLK197目的片段。構(gòu)建過表達(dá)重組植物表達(dá)載體，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)水稻愈傷組織的技術(shù)得到了OsRLK197轉(zhuǎn)基因株系，篩選并鑒定得到5個(gè)陽性株系。通過觀察轉(zhuǎn)基因植株在田間的表型，并對其進(jìn)行包括株高、有效穗及于粒重農(nóng)藝學(xué)性狀的考察，與野生型比較OsRLK197過表達(dá)植株的株高增加、有效穗數(shù)減少、千粒重?zé)o明顯差異。
　　(3)采用轉(zhuǎn)化擬南芥原生質(zhì)體的方法

5、瞬時(shí)表達(dá)發(fā)現(xiàn)OsRLK197基因亞細(xì)胞定位于細(xì)胞膜上，與之前生物信息學(xué)的預(yù)測結(jié)果一致;采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)分析得出，該基因在幼葉及種子中的表達(dá)量最高，在根中的表達(dá)量最低。
　　(4)已知OsRLK197基因的胞內(nèi)具有激酶域，構(gòu)建激酶域原核表達(dá)載體，IPTG誘導(dǎo)原核重組蛋白表達(dá)，并進(jìn)行純化，以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　(5)對野生型水稻日本晴進(jìn)行ABA、NaCl及干旱處理，并采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)研究OsRLK197在不同脅

6、迫處理下的mRNA表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)OsRLK197在ABA和NaCl的處理?xiàng)l件下，隨著處理時(shí)間的增加表達(dá)量升高，而在干旱處理下，表達(dá)量隨時(shí)間增長而呈現(xiàn)遞減，該結(jié)果說明OsRLK197的表達(dá)可能受到ABA、NaCl及干旱處理的誘導(dǎo)，該基因響應(yīng)逆境脅迫。
　　綜上所述，本論文首次克隆得到RLKs受體蛋白激酶家族的OsRLK197基因，構(gòu)建過表達(dá)載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)水稻愈傷組織轉(zhuǎn)化技術(shù)得到過表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株。利用生物信息學(xué)方法對OsRLK1

7、97的結(jié)構(gòu)域及蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)，啟動子序列響應(yīng)元件進(jìn)行分析。分析不同組織表達(dá)情況進(jìn)而發(fā)現(xiàn)OsRLK197在水稻各組織中均存在表達(dá)。對野生型水稻日本晴進(jìn)行ABA、NaCl及干旱處理，發(fā)現(xiàn)其表達(dá)量受NaCl及干旱處理的誘導(dǎo)，響應(yīng)ABA激素信號通路。對OsRLK197這一新的水稻RLKs的克隆及功能初步分析，對該基因在響應(yīng)ABA信號通路及逆境脅迫的具體作用機(jī)制的研究奠定了重要的基礎(chǔ)，也為揭示水稻RLKs在植物的生長發(fā)育過程、信號傳導(dǎo)及抗逆脅迫