納米鋁佐劑的制備及輔佐HPAIV H5N1的免疫學(xué)研究.pdf

1、目的：利用納米氫氧化鋁佐劑輔佐高致病性禽流感H5N1(Highly pathogenic avian influenza virus，HPAIV H2N1)快速提早、提高抗體水平，降低目前使用普遍的油佐劑苗對機體胴體品質(zhì)降低影響。 方法： 1.采用微乳液法制備經(jīng)過激光粒度儀測定，在高壓均質(zhì)過程中選第三和第四循環(huán)的產(chǎn)物，進(jìn)行激光粒度儀測定。 2.通過測定濁度、pH值和粒徑三項指標(biāo)，對比121℃，30min高溫高壓滅

2、菌處理NAHA(nanoparticulated aluminum hydroxide adjuvant,NAHA)前后的變化，評價納米氫氧化鋁佐劑滅菌方式。 3.用哈爾濱獸醫(yī)研究所制苗用HPAIV(H5N1)尿囊液自制油苗、兩種粒徑納米鋁佐劑苗，即油苗組、NP80組、NP219組，分別右側(cè)(左側(cè)為對照，不注射任何物質(zhì))胸肌注射相應(yīng)疫苗和對照組進(jìn)行比較，在14日齡，17日齡，19日齡，21日齡，24日齡，28日齡，31日齡，35

3、日齡，42日齡，49日齡翅靜脈采血按照中華人民共和國農(nóng)業(yè)部規(guī)范的微量血凝抑制實驗測定。HPAIV(H5N1)。HA抗體水平:在21日齡，28日齡，35日齡，42日齡心臟采血，淋巴細(xì)胞分離液分離淋巴細(xì)胞，測定總玫瑰花環(huán)形成率和淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化水平。 4.以納米氫氧化鋁苗(右側(cè)胸肌)、油苗(右側(cè)胸肌)和對照(相同個體左側(cè)胸肌)進(jìn)行了眼檢查觀(17日齡，21日齡)，病理組織學(xué)和反映炎癥程度的MPO水平(21日齡，35日齡，49日齡)方面的

4、研究，評價相應(yīng)佐劑的副作用。 結(jié)果： 1.初步獲得相對比較穩(wěn)定的平均粒徑與HPAIV(H5N1)病毒顆粒大小接近的80nm和大于此病毒顆粒的219 nm的兩種粒徑氫氧化鋁佐劑。 2.在經(jīng)過高溫高壓處理后pH值有輕微的降低，濁度、粒徑大小與處理前差異不顯著，粒徑分布沒有較大的變化。從而證實NAHA在疫苗的制備過程中可以使用121℃，30min進(jìn)行滅菌處理。 3.納米鋁佐劑苗組21日齡(免疫后7d)表現(xiàn)出迅速

5、提高有效抗體的效果，比油苗組24日齡(免疫后10d)要提前3d，兩組納米佐劑苗之間抗體滴度差異不顯著，兩組納米佐劑苗抗體持續(xù)的時間不如油苗持久；21日齡、28日齡、35日齡、42日齡玫瑰花環(huán)形成率和淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率在納米鋁佐劑組、油苗組和對照組間沒有顯著差異(P<0.05)。 4.17日齡(免疫后3d)兩個納米佐劑組刺激性很大，肌肉表現(xiàn)潮紅、水腫，油苗組反應(yīng)相對較輕，吸收不良，未被吸收乳白色油苗清晰可見：21日齡，兩個納米鋁佐劑組

6、疫苗基本被吸收殆盡，而油苗組尚有多量未被吸收的淡黃色疫苗痕跡；35日齡，肉眼不易辨別納米鋁和油佐劑的差異。肌肉組織切片H．E染色比較，隨著日齡增長，各組炎癥輕重不同，在21日齡時兩組納米鋁佐劑組和油苗組炎性細(xì)胞浸潤劇烈，肌纖維間充滿炎性細(xì)胞，肌纖維扭曲變形明顯，注射部位形成炎灶。35日齡時兩組納米鋁佐劑組炎灶逐漸縮小，而油苗組仍表現(xiàn)很強炎性細(xì)胞聚集。49日齡時兩組納米鋁佐劑組炎性細(xì)胞已經(jīng)被吸收殆盡，僅在毛細(xì)血管周圍殘存尚未被完全吸收的炎

7、性細(xì)胞；油苗組仍有大量炎性細(xì)胞未被吸收，炎灶明顯。對照組沒有明顯變化，肌纖維完整。MPO水平測定發(fā)現(xiàn)。隨著日齡的增長(免疫時間的延長)，MPO值逐漸降低，在21日齡，35日齡，49日齡兩組納米鋁佐劑組與油苗組差異極顯著(P>0.01)，35日齡兩組納米佐劑組間差異顯著(P>0.05)。 結(jié)論： 采用微乳液法制備的兩種粒徑納米氫氧化鋁佐劑可以使用高溫高壓(121℃，30min)方式進(jìn)行滅菌處理，即對濁度、粒徑?jīng)]有顯著影響，

8、pH值有所降低。但是沒有發(fā)生電性的根本轉(zhuǎn)變。納米氫氧化鋁佐劑用做HPAIV(H5N1)的免疫佐劑，在抗體水平測定中表現(xiàn)出提高HPAIV(H5N1)的抗體水平，比油佐劑苗提前(3d)得到有效抗體應(yīng)答的效果；納米鋁佐劑與油佐劑苗相比還可以在眼觀、組織病理學(xué)、MPO水平三項指標(biāo)中降低佐劑的副作用。 高致病性禽流感(Highly pathogenic avian influenza，HPAI)已經(jīng)在亞洲，非洲，歐洲等地域呈世界范圍內(nèi)流行

9、，引起家禽、野生候鳥乃至人類的死亡。進(jìn)行有效的免疫接種是防制HPAI暴發(fā)、傳播的重要措施之一，目前禽類HPAI(H5N1)防疫工作中使用的疫苗是HPAIV(H5N1)全病毒滅活油佐劑苗，主要抗原成分是血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)，由于HA能夠誘導(dǎo)機體產(chǎn)生有效的中和抗體，從而可以阻止其對機體的侵害。眾所周知，在有些抗原中添加佐劑可以提高免疫水平，油佐劑只在動物疫苗中使用，其它免疫佐劑研究雖很寬泛，但是由于諸多因素影響在臨床中未獲普遍

10、使用。氫氧化鋁作為廣泛認(rèn)可的且被美國FDA等批準(zhǔn)的佐劑，在疫苗中使用80余年以來，不僅可以提高機體對某些抗原的免疫應(yīng)答而且具有可靠的安全性，但是隨著使用時間的延長，也表現(xiàn)出很多需要改進(jìn)的地方，如：抗體產(chǎn)生時間慢、抗體水平不高、注射位點的局部強刺激、對某些抗原無效以及為應(yīng)對進(jìn)一步開發(fā)新型疫苗如：亞單位疫苗、核酸疫苗等的需要；其詳細(xì)作用機理、在體內(nèi)的詳細(xì)途徑和如何輔佐更多的抗原(如：百日咳無效)以及進(jìn)一步提高細(xì)胞免疫水平也值得深入研究?？乖?/p>