抗H5N1亞型流感病毒的寡核苷酸藥物篩選及其活性研究.pdf

1、本文以中國(guó)大陸分離的人H5N1亞型高致病性禽流感病毒作為研究對(duì)象，分別篩選出針對(duì)該病毒膜蛋白和內(nèi)部蛋白的寡核苷酸藥物，并檢測(cè)了其抗病毒活性，以期為研制新型抗流感病毒藥物提供新的思路。全文包括三個(gè)部分： 一、H5N1亞型流感病毒血凝素的序列分析及其在大腸桿菌的表達(dá)與純化。 首先，利用RT-PCR技術(shù)，擴(kuò)增得到中國(guó)大陸分離的首例人H5N1亞型禽流感病毒的血凝素基因，然后對(duì)推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行了生物信息學(xué)分析?？乖砦环治霰砻?/p>

2、，該蛋白含有23個(gè)可能的抗原表位，其中17個(gè)抗原表位位于HA1亞單位；N-糖基化分析發(fā)現(xiàn)HA含有7個(gè)糖基化位點(diǎn)，其中5個(gè)位于HAl亞單位；對(duì)16株分離自不同年代、地區(qū)和不同宿主的H5N1亞型高致病性禽流感病毒的血凝素蛋白進(jìn)行同源序列比較，發(fā)現(xiàn)其受體結(jié)合區(qū)保持了相對(duì)的穩(wěn)定性，裂解位點(diǎn)鄰近的氨基酸序列為PLRERRRKR，符合高致病性禽流感病毒的特征；利用同源建模的方法，分析了A/Hong Kong/156/97(H5N1)和A/Anhui

3、/1/2005(H5N1)的HA1三級(jí)結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)二者具有相當(dāng)大的相似性，這就為基于結(jié)構(gòu)進(jìn)行的核酸藥物研究奠定了基礎(chǔ)。進(jìn)而將去除信號(hào)肽序列的HA1克隆至原核表達(dá)載體pQE-80L，轉(zhuǎn)化大腸桿菌后用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HA1以包涵體形式表達(dá)，表達(dá)量達(dá)30％以上。將此包涵體變性裂解后過(guò)鎳離子親和柱純化，SDS-PAGE分析蛋白純度達(dá)90％以上；Western-blot結(jié)果顯示表達(dá)的蛋白大小約為37kD，并具有良好的免疫原性。我們隨后大量

4、制備了HA1蛋白，免疫小鼠，得到了高效價(jià)的鼠源HA1多克隆抗體。 二、抗H5Nl亞型流感病毒血凝素蛋白的DNA適配子篩選及其活性鑒定。 在獲得純化的HA1蛋白的基礎(chǔ)上，應(yīng)用SELEX技術(shù)篩選針對(duì)該蛋白的DNA適配子。合成了79個(gè)堿基的單鏈DNA文庫(kù)，其兩端序列固定、中間為40個(gè)堿基的隨機(jī)序列。將其與靶蛋白孵育，利用靶蛋白帶His標(biāo)簽的特性，將蛋白-核酸復(fù)合物過(guò)鎳離子親和柱，采用含100mM咪唑的洗脫液將特異性結(jié)合的復(fù)合物

5、洗脫下來(lái)。隨后以此為模板，以生物素標(biāo)記的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)熱變性后產(chǎn)生的單鏈DNA庫(kù)投入下一輪篩選。如此反復(fù)篩選11輪，將每輪篩選產(chǎn)物以HA結(jié)合法分析隨機(jī)DNA文庫(kù)的富集程度。結(jié)果顯示，單鏈DNA庫(kù)與靶蛋白的親和性逐漸升高，到第9輪后就不再上升。將第11輪的篩選產(chǎn)物PCR擴(kuò)增后克隆至pGEM-Teasy載體，通過(guò)藍(lán)白斑篩選隨機(jī)挑選80個(gè)克隆。從中選擇25個(gè)克隆測(cè)定DNA序列，分析了其二級(jí)結(jié)構(gòu)并測(cè)定了HA結(jié)合活性。發(fā)現(xiàn)它們分為

6、三個(gè)不同的家族(family)，其中第Ⅲ家族的10號(hào)適配子(A10)結(jié)合活力最強(qiáng)。進(jìn)一步比較該適配子對(duì)HA1蛋白和全病毒的親和性，發(fā)現(xiàn)其對(duì)后者親和力更強(qiáng)。然后，大量化學(xué)合成適配子A10和A05，在流感病毒感染的MDCK細(xì)胞上進(jìn)行抗病毒活性檢測(cè)。發(fā)現(xiàn)用75pmol或100pmol的適配子A10處理后，病毒滴度顯著下降，而細(xì)胞活力增強(qiáng)。證明所篩選的DNA適配子可在體外有效地抑制H5N1亞型流感病毒復(fù)制。 三、靶向A型流感病毒內(nèi)部基因

7、的siRNA篩選及其活性鑒定。根據(jù)H5N1和H1N1亞型流感病毒的PB1、PA、NP和NS四個(gè)內(nèi)部蛋白編碼基因的同源性序列，設(shè)計(jì)了四條針對(duì)不同基因的21nt siRNA，并以A/CNIC/246/2000(H1N1)(簡(jiǎn)稱“246毒株”)作為模式病毒，進(jìn)行抗病毒試驗(yàn)。首先比較了不同細(xì)胞對(duì)246毒株的敏感性。隨后選擇A549作為宿主細(xì)胞，對(duì)轉(zhuǎn)染條件進(jìn)行了摸索。流式細(xì)胞術(shù)和熒光顯微鏡檢測(cè)顯示Hiperfect/siRNA比為3μl：5nM時(shí)

8、、siRNA劑量為50nM時(shí)就可導(dǎo)致基因沉默。在此基礎(chǔ)上，我們將這四種siRNA分別轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞，然后接種流感病毒，在不同時(shí)段檢測(cè)siRNA抑制病毒的效果。結(jié)果表明，與轉(zhuǎn)染對(duì)照siRNA組相比，四種siRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞呈現(xiàn)不同程度的病毒抑制。分析各組的病毒滴度、RNA拷貝數(shù)及蛋白質(zhì)水平的變化，發(fā)現(xiàn)RNAi抑制病毒效果最好的依次是：siNP、siPB1、siNS、siPA。流式細(xì)胞術(shù)和熒光顯微鏡分析結(jié)果顯示，針對(duì)PB1的siRNA可抑

9、制病毒引起的細(xì)胞凋亡。進(jìn)而檢測(cè)了siRNA在雞胚抑制病毒的活性。將這四種siRNA分別接種雞胚，同時(shí)接種流感病毒。培養(yǎng)17hr后取雞胚尿囊液檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，它們對(duì)流感病毒的抑制效果與體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。說(shuō)明我們?cè)O(shè)計(jì)的siRNA可以有效抑制流感病毒的復(fù)制，有望應(yīng)用于控制流感病毒感染。 綜上所述，本研究首次篩選到針對(duì)人H5N1亞型禽流感病毒血凝素蛋白的DNA適配子，并證明其在體外有抗病毒活性；本研究還首次報(bào)導(dǎo)針對(duì)流感病毒NP尾部編碼基因和P