Gluc-GFP雙標記系統(tǒng)及H5N1假病毒的構(gòu)建與驗證.pdf

1、光學分子影像學對于病毒的標記研究有著重要的意義。在流感病毒研究領域，標記病毒的研究一直層出不窮，對于流感病毒致病機理和感染規(guī)律的研究有著巨大的推動作用。對于一些傳染性強、致死率高的流感病毒來說，假病毒的構(gòu)建消除了其存在的安全隱患，以其優(yōu)良的安全性和穩(wěn)定性為病毒致病機理的研究和疫苗的研發(fā)提供了有效的技術手段。
　　在生物學研究領域最常用的分子影像學方法是熒光分子成像（Fluorescence）和生物發(fā)光成像（Bioluminesce

2、nce）兩大類。熒光分子成像技術和生物發(fā)光成像技術它們都有各自的優(yōu)缺點：生物發(fā)光無自發(fā)熒光,特異性強，靈敏度高，能夠精確定量，但信號較弱，檢測時間較長，要求高，實驗成本高；熒光分子成像信號強度高，成像速度快，實驗成本低，能夠保持研究的連貫性，但檢測深度受限制，較難精確體內(nèi)定量。本實驗選用了其中的綠色熒光蛋白Green fluorescent protein（GFP）和Gaussia熒光素酶Gaussia luciferase（Gluc）

3、同時用于分子成像，綜合了兩者優(yōu)勢的同時彌補了彼此的不足。
　　H5N1禽流感屬高致病性流感病毒，傳播快，病死率高。對于高致病性的病毒進行實驗研究需要在高等級的生物安全實驗室進行，增加了實驗的成本和難度，H5N1假病毒的構(gòu)建克服了其生物安全問題，在低等級的生物安全實驗室即可完成相關病毒實驗。本實驗H5N1假病毒的構(gòu)建為H5N1病毒致病性的研究和抗病毒藥物研制及篩選提供了一種安全有效的技術手段。
　　本課題根據(jù)文獻報道合成 sp

4、lit-GFP基因，分別構(gòu)建含 G1-10與 G11的pcDNA3.1表達質(zhì)粒并通過熒光觀察驗證其相互作用。然后通過融合PCR技術將Gluc基因與G11基因通過Linker連接并插入到pcDNA3.1上，與G1-10表達質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細胞，測定細胞上清中Gluc熒光素酶的活性，并進行GFP熒光觀察。為了更方便對病毒進行細胞水平的觀測和篩選，利用慢病毒表達系統(tǒng)構(gòu)建能穩(wěn)定表達 G1-10的 MDCK細胞系，再向細胞系中轉(zhuǎn)染 G11質(zhì)粒，

5、通過 RFP標記和嘌呤霉素的抗性對細胞系以及 GFP活性進行篩選與驗證。實驗結(jié)果表明Gluc-G11與 G1-10質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染后，細胞能夠發(fā)出明亮的綠色熒光，上清中熒光素的活性也較高。在此基礎上，建立的 G1-10 MDCK細胞系能夠穩(wěn)定表達出G1-10，用G11質(zhì)粒轉(zhuǎn)染該細胞系后，可檢測到GFP熒光。本課題成功構(gòu)建的含Gluc-GFP的雙標記系統(tǒng)，為在細胞和活體水平研究病毒致病機制提供了技術手段。
　　本課題應用構(gòu)建好的含H5N1