[學(xué)習(xí)]分子免疫學(xué)_之_抗體的制備及應(yīng)用

1、抗體的制備及應(yīng)用,一、抗體的一些基本概念,單克隆抗體 (Monoclonal Antibody,McAb) 單個(gè)B淋巴細(xì)胞克隆所分泌的抗體多克隆抗體 (Polyclonal Antibody) 多個(gè)B淋巴細(xì)胞克隆所分泌的抗體,抗原（antigen ，Ag）,表位，抗原結(jié)合位點(diǎn)，抗原決定簇（epitope）,Ag,,,,,,,,,1,2,3,4,Ag,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,單克隆抗體,B1,B

2、2,B3,B4,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,B3,B3,B3,B3,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,2,多克隆抗體,3,4,,,,,1,,,,,,,,,,,,1、單克隆抗體的特點(diǎn),特異性強(qiáng)，具有抗原結(jié)合位點(diǎn)的專一性。（不是抗原的專一性?。┮蚪Y(jié)合位點(diǎn)的單一性，有時(shí)不易捕捉抗原，一株單克隆抗體與抗原不易產(chǎn)生凝集反應(yīng)或沉淀反應(yīng)。,抗體的性質(zhì)相同，容易純化、標(biāo)記。,腦垂體分泌的一些激素：,hFSH 促卵泡激素hL

3、H 促黃體生成素hTSH 促甲狀腺激素hCG #絨毛膜促性腺激素,,β,α,β,α,α,β,β,α,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,單克隆抗體有交叉反應(yīng)是由于不同的抗原上有完全相同的表位（100%的交叉反應(yīng)）,或有相似的表位（不同程度的交叉反應(yīng)）。,產(chǎn)生凝集反應(yīng)的原理,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,1,1,3,3,2,3,2,2,1,

4、1,1,1,1,,,1,2,2,3,2,3,2,2,1,1,3,,購(gòu)買抗體時(shí)要注意廠商的標(biāo)注,適合于做什么實(shí)驗(yàn),使用濃度多少WB（Western blotting ，免疫印跡)IH (Immunohistochemistry, 免疫組織化學(xué))IC (Immunocytochemistry, 免疫細(xì)胞化學(xué))IEM (Immune lectron microscopy,免疫電鏡)FCM (Flow Cytometry,流式細(xì)胞儀)

5、ELISA(enzyme linked immunosorbent assey, 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn),酶聯(lián)免疫分析),2、多克隆抗體的特點(diǎn),多抗是單抗的混合物，因此多抗的性質(zhì)是一個(gè)群體綜合的性質(zhì)。特異性一般比單抗差 因?yàn)橛刹煌再|(zhì)的抗體組成，只要其中含交叉反應(yīng)的抗體，多抗就有交叉反應(yīng)，所以多抗更容易有交叉反應(yīng)。,比單抗更容易捕捉抗原。 因?yàn)楹锌共煌砦坏目贵w，多種抗 體都可與抗原結(jié)合。,抗體的純化、標(biāo)記比單抗

6、難 因?yàn)楹懈鞣N不同類型、亞類的抗體， 提純、標(biāo)記的方法有所差別。同時(shí),血 清中含有的雜蛋白比較多.,二、抗體的制備,1、單克隆抗體的制備無(wú)法采用生物化學(xué)的方法從多抗中分離必須采用細(xì)胞雜交的方法來(lái)制備能否篩選到理想的單克隆抗體有技術(shù)問(wèn) 題也有機(jī)遇問(wèn)題,制備單克隆抗體的基本原理：,致敏的B淋巴細(xì)胞 骨髓瘤細(xì)胞 （myeloma） （能夠分泌特異性的抗體 ，

7、 （不能分泌特異性的抗體， 不能在體外長(zhǎng)期生存 ） 但能在體外長(zhǎng)期生存） 陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞 (hybridoma) （既能分泌特異

8、性抗體， 又能夠在體外長(zhǎng)期生存）克隆化培養(yǎng) （產(chǎn)生單克隆的陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞）生產(chǎn)單克隆抗體,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,1,2,2,2

9、,2,,,1,2,2、多抗的制備常用的免疫動(dòng)物免疫的基本步驟如何免疫兔子,,1）常用的免疫動(dòng)物,兔子（rabbit）：最常用于自制抗體， 抗體量較多。（新西蘭,大耳白）小鼠（mouse）：可用于自制抗體，但 抗體量很少。（BALB/C,昆明鼠）大鼠（rat）：可用于自制抗體，免疫過(guò) 程要麻醉動(dòng)物。（Wistar大鼠）,,羊（sheep、goat）：常用

10、于較大批量地 生產(chǎn)抗體（商品）。馬（horse）：常用于大批量生產(chǎn)治療用 抗體（商品）。豚鼠（guinea pig）：國(guó)外實(shí)驗(yàn)室常用。,2）免疫的基本步驟,基礎(chǔ)免疫：首次，抗原用量大，用佛式完全 佐劑（Complate Freund’ adjuvand ,

11、 含礦物油,卡介苗等).加強(qiáng)免疫：第2次以后，抗原量減半，多次， 間隔2-4周，用佛式不完全佐劑 (Incomplate Freund’ adjuvand , 不含卡介苗).,取血測(cè)效價(jià)： 加強(qiáng)免疫兩次或三次以后的第7天取血。放血制備血清： 最后一次免疫后7-10天放血。 (在三

12、角瓶中加一些生理鹽水，放血放置一段時(shí)間，凝固，吸取血清，離心，分裝，凍存),3) 如何免疫兔子,2000g(雌雄均可),健康,無(wú)病原（小鼠20g，大鼠200g）基礎(chǔ)免疫0.5ml抗原(含0.25~0.5mg蛋白或108顆?？乖?0.5ml佛式完全佐劑(CFA)（小鼠0.2ml）制備抗原-佐劑乳化液背部、頸部皮下多點(diǎn)注射或腿部肌肉注射（注意：不要剪毛）,加強(qiáng)免疫間隔2-4周,可進(jìn)行多次0.5ml抗原(蛋白量減半)0.5ml

13、佛式不完全佐劑(IFA)制備抗原-佐劑乳化液背部、頸部皮下多點(diǎn)注射或腿部肌肉注射,免疫3~4次以后從耳靜脈取血檢測(cè)效價(jià)酶聯(lián)法：1:104以上，能達(dá)到1:106。免疫雙擴(kuò)散： 1:16以上，能達(dá)到1:64效價(jià)達(dá)到要求的可放血制備血清可一次放血(頸動(dòng)脈)也可多次取血(耳靜脈),單抗與多抗的區(qū)別,單抗 多抗抗體組成 單一

14、復(fù)雜 抗體性質(zhì) 個(gè)體的屬性 群體綜合的性質(zhì)純化標(biāo)記 容易，效果好 難度高一些 種屬來(lái)源 絕大多數(shù)是小鼠 兔子、羊、豚鼠等制備周期 長(zhǎng) (最短4個(gè)月） 短（2個(gè)月）制備技術(shù) 復(fù)雜 簡(jiǎn)單經(jīng)費(fèi)

15、 多 少,,,什么情況需要制備單抗,目的蛋白有結(jié)構(gòu)類似物抗原不純，無(wú)法分開多抗效果不好（已排除非特異性反應(yīng)）希望將抗體用于治療，研制成藥品希望將抗體用于診斷，研制成診斷試劑,三、抗體的純化,鹽析法（硫酸銨沉淀)辛酸-硫酸銨沉淀法離子交換法親和層析法凝膠過(guò)濾法,1、鹽析法（硫酸銨沉淀),原理在高濃度中性鹽存在下,蛋白質(zhì)在水中的溶解度降低而產(chǎn)生沉淀硫酸銨是最常用的

16、中性鹽不同蛋白質(zhì)的鹽析常數(shù)不同硫酸銨的加入量通常以飽和度表示 (100%飽和度:767g/L),主要步驟在血清或腹水中加入硫酸銨使抗體沉淀；4℃高速離心,棄上清,溶解沉淀； 可反復(fù)操作,逐級(jí)降低硫酸銨的濃度: 50%飽和度: 0.313g/ml 45%飽和度: 0.277g/ml

17、 40%飽和度: 0.243g/ml最后一次離心后,用少量PBS溶解沉淀,透析， 測(cè)定濃度。,特點(diǎn)成本低，步驟簡(jiǎn)單?？贵w的回收率比較高?？贵w純度比較低，電泳后可見到明顯的雜帶,不適合于做各種標(biāo)記。需要高速離心機(jī)。,2、正辛酸-硫酸銨沉淀法,原理兩步沉淀：先加正辛酸去雜蛋白. 正辛酸是一種有機(jī)酸,在酸性條件下(pH4.5)可使大分子的雜蛋白沉淀.后加硫酸銨使抗體沉淀.,主要步驟：調(diào)節(jié)樣品的pH值,加入正辛酸

18、(25ul/ml),攪拌30分；。室溫高速離心(10000g，30分鐘),收集上清液；再加入硫酸銨（40%飽和度）；4℃高速離心(10000g，15分鐘) ,棄上清；溶解沉淀，透析，測(cè)定濃度。,特點(diǎn)成本較低，步驟較復(fù)雜。抗體回收率很低?？贵w純度高，電泳后雜帶很少，適合于各種標(biāo)記。需要高速離心機(jī)，耐高速離心的玻璃離心管。,3、離子交換法,原理利用溶液中各種帶電粒子與離子交換劑之間結(jié)合力的差異進(jìn)行物質(zhì)分離.DEAE是一種

19、陰離子交換劑，自身帶正電荷 (Diethylaminoethyl,二乙氨基乙基)將樣品的pH值調(diào)至等電點(diǎn)以上,使樣品帶負(fù)電荷.采用鹽溶液洗脫,通過(guò)高濃度的帶同種電荷的離子(Cl-)置換被分離的組分.,,,,,,,,+,+,+,,,,,,,,,+,+,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,- - - - -

20、 - - -,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,帶負(fù)電荷 的被吸附上,帶負(fù)電荷少的先被置換,帶負(fù)電荷多的后被置換,NaCl Tris 梯度混合儀,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,連續(xù)梯度洗脫:,,,,,,,,,,,,,,,,,

21、,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,階段洗脫:,,,,T,離子強(qiáng)度,蛋白濃度,T,,,倒入一定濃度的NaCl溶液,,,通過(guò)離心來(lái)分離,主要步驟 先用硫酸銨沉淀抗體，粗提；將樣品過(guò)柱；洗去沒(méi)有結(jié)合的物質(zhì)；用梯度NaCl溶液洗脫，等量收集洗脫液；紫外分光光度計(jì)測(cè)量，保留A280值明顯升高的樣品；匯集樣品，濃縮，測(cè)定濃度。,特點(diǎn)成本較低，步驟較簡(jiǎn)單。抗體回收率較高。抗體純度較

22、高，電泳后可見少量雜帶，適合于各種標(biāo)記。純化后抗體體積大，需要濃縮。需要冷柜，自動(dòng)收集器。,4、親和層析法,原理利用蛋白質(zhì)之間的特異性結(jié)合 （抗體-抗原，受體-配體）將一種配基與凝膠顆粒結(jié)合,捕捉與它相配的物質(zhì)。洗脫一般采用改變pH值的方法,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,

23、,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,使用前,樣品結(jié)合(Binding),洗脫(Elution),,,,,主要步驟 將Protein A與活化的柱子相結(jié)合(買商品柱)；將腹水或血清處理后過(guò)柱；用結(jié)合緩沖液洗柱子，直到A280值為零；用甘氨酸緩沖液洗脫抗體，等量收集洗脫液；測(cè)定洗脫液的A280值，保留A280值明顯升高的樣品；匯集樣品，濃縮，

24、測(cè)定濃度。,葡萄球菌A蛋白 (staphylococcal protein A,SPA)金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁上的一種蛋白分子量42000,等電點(diǎn)pH5.1可與大多數(shù)動(dòng)物Ig的Fc段結(jié)合一個(gè)SPA分子有4個(gè)相似的活性部位與IgG的結(jié)合最強(qiáng),與IgM,IgA的結(jié)合較差,特點(diǎn)成本高，步驟較簡(jiǎn)單?？贵w回收率低?？贵w純度高，適合于各種標(biāo)記。純化后抗體體積大，需要濃縮。需要自動(dòng)收集器。,5、凝膠過(guò)濾法(分子篩),原理將

25、樣品混合物通過(guò)一定孔徑的凝膠介質(zhì),由于流經(jīng)路徑的差異,使不同分子質(zhì)量的組分分離.大分子物質(zhì)直接從凝膠顆粒外通過(guò)，走得快；小 分子物質(zhì)進(jìn)入凝膠顆粒的內(nèi)部再出來(lái)，走得慢。適合于IgM類抗體的純化 (五聚體,分子量約800KD),,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,主要步驟將腹水或血