抗EBV LMP2A單克隆抗體的制備、鑒定及免疫學(xué)特性分析.pdf

1、目的:
　　EB病毒（Epstein-Barr virus，EBV）屬人類γ皰疹病毒，在全球廣泛分布，約95％以上的成人所攜帶，呈潛伏感染狀態(tài)，與鼻咽癌、Burkitt淋巴瘤等多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)。在EBV潛伏感染的細(xì)胞中，表達(dá)十多種EBV基因產(chǎn)物，包括EBV核抗原(EB nuclear antigen，EBNA)1、2、3A、3B、3C和LP，潛伏膜蛋白(latent membrane protein，LMP)1和2A、2B

2、，EBV編碼的小RNA(EBER)1和2以及BamHⅠ的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。近年許多關(guān)于LMP2A的研究報(bào)道指出，EBV潛伏感染的B細(xì)胞中均有LMP2A的表達(dá)，鼻咽癌和其他EBV相關(guān)惡性腫瘤中可持續(xù)檢測(cè)到LMP2A的轉(zhuǎn)錄表達(dá)產(chǎn)物(mRNA)，LMP2A可在沒(méi)有BCR提供信號(hào)的情況下促進(jìn)B細(xì)胞的增殖和存活，并且LMP2A是鼻咽癌、淋巴瘤等腫瘤細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)的EBV保守抗原，在維持病毒的潛伏感染狀態(tài)和細(xì)胞轉(zhuǎn)化過(guò)程中發(fā)揮重要作用，并參與調(diào)節(jié)跨膜信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)

3、。目前認(rèn)為L(zhǎng)MP2A是鼻咽癌等EBV相關(guān)惡性腫瘤免疫治療的理想靶抗原。
　　本研究運(yùn)用基因工程技術(shù)選擇抗原性較強(qiáng)的兩個(gè)LMP2A胞外區(qū)表位基因并將其串聯(lián)，連接載體后導(dǎo)入大腸桿菌中表達(dá)LMP2A表位融合蛋白，并檢測(cè)其免疫原性;應(yīng)用雜交瘤技術(shù)，制備抗LMP2A的特異性單克隆抗體，對(duì)該單克隆抗體進(jìn)行鑒定和免疫學(xué)功能分析;應(yīng)用純化后的單克隆抗體進(jìn)行EBV相關(guān)鼻咽癌病人的免疫組化檢測(cè)，為進(jìn)一步進(jìn)行鼻咽癌診斷和分子靶向治療奠定基礎(chǔ)。
　

4、　方法:
　　1.LMP2A重組表位融合蛋白基因的串聯(lián)以及構(gòu)建融合蛋白原核表達(dá)載體
　　依據(jù)Genebank中的LMP2A基因序列以及大量相關(guān)文獻(xiàn)，且經(jīng)軟件分析后選擇抗原性較強(qiáng)的LMP2A第二位和第五位表位基因，優(yōu)化LMP2A表位基因序列并將LMP2A第二、五胞外區(qū)基因串聯(lián)，限制內(nèi)切酶在5'端和3'端雙酶切位點(diǎn)BamHⅠ和XhoⅠ進(jìn)行雙酶切，將重組串聯(lián)基因克隆于pET28a原核表達(dá)載體中，構(gòu)建LMP2A表位融合蛋白的重組表達(dá)

5、載體。
　　2.LMP2A重組表位融合蛋白的表達(dá)、純化與鑒定
　　將原核重組表達(dá)載體pET28a-LMP2A轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌BL21中誘導(dǎo)LMP2A融合蛋白的表達(dá)。表達(dá)的蛋白變性處理后用Ni-NTA親和層析柱純化，復(fù)性后進(jìn)行SDS-PAGE電泳并用Coomassie blue染色、脫色、鑒定蛋白純度。用商品化大鼠抗人LMP2A IgG對(duì)純化后的LMP2A重組表位融合蛋白進(jìn)行Westernblotting鑒定。
　　3.

6、抗LMP2A單克隆抗體的制備與純化
　　以純化后的LMP2A重組表位融合蛋白作為抗原免疫小鼠，取小鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞SP2/0融合，HAT培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)，經(jīng)克隆以及多次亞克隆后篩選出能夠穩(wěn)定分泌鼠抗人LMP2A的雜交瘤細(xì)胞株。取雜交瘤細(xì)胞注射入小鼠腹腔經(jīng)腹水誘生方法產(chǎn)生腹水。經(jīng)親和層析柱Protein G純化，測(cè)定抗體濃度。
　　4.抗LMP2A單克隆抗體的亞類分析、鑒定及免疫學(xué)功能分析
　　純化后的單克隆抗體經(jīng)免疫

7、球蛋白亞類測(cè)定試劑盒測(cè)定抗體的亞類，ELISA測(cè)定其效價(jià)，SDS-PAGE鑒定抗體重輕鏈，以及一系列免疫學(xué)功能分析，包括Western blotting、免疫熒光、流式細(xì)胞術(shù)等。
　　5.單克隆抗體的免疫組化檢測(cè)
　　收集33例鼻咽癌患者組織石蠟標(biāo)本，切片脫蠟至水，以純化后單克隆抗體為一抗并以無(wú)關(guān)抗體作為對(duì)照，檢測(cè)EB病毒相關(guān)鼻咽癌病人組織切片中LMP2A蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1.EB病毒LMP2A重組表

8、位融合蛋白基因的構(gòu)建、蛋白的表達(dá)與純化
　　經(jīng)DNAstar軟件分析LMP2A編碼基因序列，LMP2A第二、五胞外區(qū)重復(fù)串聯(lián)基因與原先設(shè)計(jì)的目的蛋白序列一致，轉(zhuǎn)化大腸埃希菌BL21，誘導(dǎo)表達(dá)的LMP2A重組融合蛋白純化后經(jīng)Western blotting，SDS-PAGE鑒定，提示蛋白的分子量約為12KDa。運(yùn)用該融合蛋白制備的血清抗體經(jīng)ELISA及SDS-PAGE、Western blotting檢測(cè)提示該融合蛋白效價(jià)高且具有較

9、好的免疫原性。
　　2.抗LMP2A單克隆抗體的制備、鑒定與免疫學(xué)功能分析
　　以LMP2A重組表位融合蛋白為抗原免疫小鼠，經(jīng)兩次亞克隆篩選出一株穩(wěn)定分泌抗LMP2A抗體的雜交瘤細(xì)胞株，定株命名為5C12-C4-A6。取雜交瘤細(xì)胞注射小鼠腹腔產(chǎn)腹水純化后，亞類分析為IgG1，輕鏈為κ，ELISA結(jié)果提示該抗體效價(jià)在1∶128000以上，Western blotting、免疫熒光、流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果均提示該抗體能夠與細(xì)胞中的LMP

10、2A蛋白特異性結(jié)合。
　　3.抗LMP2A單克隆抗體的臨床相關(guān)應(yīng)用
　　收集33例鼻咽癌患者組織石蠟標(biāo)本，以抗LMP2A單克隆抗體為一抗進(jìn)行免疫組化檢測(cè)，在33例鼻咽癌組織切片中31例出現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)，定位在胞膜與胞漿，陽(yáng)性率為93.94％，結(jié)果提示該抗體能夠與鼻咽癌組織中天然構(gòu)象的LMP2A抗原特異性結(jié)合。
　　結(jié)論:
　　本研究成功構(gòu)建并表達(dá)了LMP2A重組串聯(lián)表位融合蛋白;并利用純化后的融合蛋白制備出了一株抗人