鹽酸克倫特羅單克隆抗體的制備及特性鑒定.pdf

1、鹽酸克倫特羅(Clenbuterol，CL)，俗名“瘦肉精”，是一種人工合成的β<,2>-腎上腺素能興奮劑，具有調(diào)節(jié)動物神經(jīng)興奮及其體內(nèi)營養(yǎng)素重分配的功能。在肉畜飼料中添加鹽酸克倫特羅，可以減緩或減少脂肪沉積，增加肌肉蛋白沉積，使營養(yǎng)重新分配，從而改善肉畜胴體品質。但由于鹽酸克倫特羅難以代謝排出，會大量蓄積在動物機體內(nèi)，維持較高的殘留量，給人和動物帶來嚴重的危害。雖然國家的政策法規(guī)已經(jīng)嚴令禁止使用鹽酸克倫特羅作為飼料添加劑，但仍有違規(guī)應

2、用。因此，為保證肉品質量和人類的健康，建立準確、快速、簡便的檢測鹽酸克倫特羅殘留的方法具有重要的意義。 目前，我國使用的鹽酸克倫特羅ELISA檢測試劑盒主要依賴于進口，價格昂貴，不利于推廣使用，因此，開發(fā)具有自主產(chǎn)權的ELISA檢測試劑盒已成為當務之急。要研制鹽酸克倫特羅ELISA檢測試劑盒，首先要制備出特異性強、敏感性高的抗鹽酸克倫特羅的單克隆抗體。因此，本研究旨在研制抗鹽酸克倫特羅的單克隆抗體并進行免疫學特性鑒定。

3、本研究以重氮化法將鹽酸克倫特羅偶聯(lián)于載體牛血清白蛋白(BSA)，形成的結合抗原BSA-CL作為免疫原，與等體積的弗氏完全佐劑充分混勻后腹部及皮下多點免疫6～8周齡BALB/C小鼠，每只小鼠96μg/只。然后每隔14天后再與弗氏不完全佐劑混合免疫小鼠，共免疫2次，末次加強免疫以96μg/只尾腹腔注射。同時將CL與卵清白蛋白(OVA)偶聯(lián)制備檢測原(OVA-CL)。四次免疫后選擇免疫效價高的小鼠脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞進行細胞融合。結果

4、發(fā)現(xiàn)，365孔有融合細胞生長，融合率約為54％。 以間接ELISA法篩選出291孔能分泌抗鹽酸克倫特羅的單克隆抗體，陽性率約為80％。從中選出6株抗體采用有限稀釋法進行3次克隆，經(jīng)檢測和篩選最終獲得了18株穩(wěn)定分泌抗鹽酸克倫特羅單克隆抗體的雜交瘤細胞株，體內(nèi)誘生腹水并進行純化。挑選其中E9-C11、C11-E3、E7-G8三株高親和力的細胞株進行免疫學特性鑒定。 研究表明，三株抗體的亞類均為IgGl。細胞上清的間接ELI

5、SA效價分別為1:1280、1:1000、1:800，三株腹水效價都約為1×10<'-6>。用競爭性ELISA法測定抗體的親和常數(shù)及交叉反應性。親和常數(shù)分別為2.4×10<'-8>mol/L、2.83×10<'-8> mol/L、3.28×10<'-8>mol/L。E9-C11單抗對CL的IC<,50>為6.1035μg/L；對沙丁胺醇的IC<,50>大于781.25μg/L，交叉反應性小于0.78％；對腎上腺素、去甲腎上腺素、異丙腎上