羅丹明B單克隆抗體的制備及免疫學(xué)檢測(cè)方法的初步建立.pdf

1、羅丹明B(Rhodamine B，RB)是一種人工合成的三苯甲烷類堿性染料，因其具有鮮桃紅色曾用作食品添加劑，但是后來有實(shí)驗(yàn)證明RB具有潛在的毒性、致癌和致突變性，目前已禁止用作食品染色劑。
　　檢測(cè)RB殘留可采用傳統(tǒng)的儀器檢測(cè)方法，主要有分光光度法、高效液相色譜檢測(cè)法、超高效色譜檢測(cè)法、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、熒光探針法以及表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)等。儀器檢測(cè)法需要貴重的儀器設(shè)備、較復(fù)雜的樣品處理過程以及專門的相關(guān)技術(shù)人員，這些不利因

2、素使這些檢測(cè)方法不適用于現(xiàn)場(chǎng)高通量的樣品檢測(cè)。免疫學(xué)檢測(cè)方法基于抗原抗體特異性結(jié)合而具有高度的選擇性和靈敏度，其檢測(cè)方法簡(jiǎn)便、高效并且便于攜帶，適合大批量樣品的快速篩選。
　　本實(shí)驗(yàn)以N-羥基琥珀酰亞胺活性脂法(NHS)合成RB完全抗原，經(jīng)過透析、鑒定后免疫BALB/c小鼠，利用單克隆抗體技術(shù)、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELSIA)及小鼠腹水制備等技術(shù)，制備出針對(duì)RB特異性強(qiáng)、效價(jià)高的抗體，并在此基礎(chǔ)上建立間接競(jìng)爭(zhēng)ELSIA法和膠體金免疫

3、層析試紙條檢測(cè)方法。
　　1.RB完全抗原的合成及鑒定。
　　RB屬于半抗原，其分子結(jié)構(gòu)上本身含有羧基，通過N-羥基琥珀酰亞胺活性脂法，將RB分子上的羧基與載體蛋白(BSA，OVA)分子上的氨基偶聯(lián)起來，形成穩(wěn)定的酰胺鍵，即合成完全抗原。完全抗原經(jīng)紫外光譜掃描法和SDS-PAGE凝膠電泳法鑒定，初步判定偶聯(lián)成功。最終完全抗原經(jīng)免疫、融合及ELISA測(cè)定，表明兩種抗原的制備是成功的。利用BCA法測(cè)得RB-BSA和RB-OVA蛋

4、白濃度分別為5.4mg/mL和3.4mg/mL。
　　2.RB單抗制備。
　　采用實(shí)驗(yàn)室常規(guī)免疫方案免疫BALB/c小鼠，用合成的人工抗原RB-BSA作為免疫原，以RB-OVA為包被原。五免后第7天小鼠斷尾采血，測(cè)血清效價(jià)及抑制情況，血清效價(jià)達(dá)1∶16000以上。利用細(xì)胞融合技術(shù)、ELISA篩選方法和有限稀釋法進(jìn)行亞克隆獲得三株可持續(xù)分泌針對(duì)RB抗體的雜交瘤細(xì)胞株2D1、4C3和7F11。采用小鼠體內(nèi)誘生法制備了抗RB單克隆

5、抗體的腹水，其蛋白濃度分別為20.6mg/mL、19.1 mg/mL和22.4mg/mL;效價(jià)分別為16000、64000和512000。采用HiTrap Protein GHP純化柱純化7F11腹水，純化后的腹水經(jīng)SDS-PAGE鑒定雜蛋白明顯減少。交叉實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該單抗與羅丹明6G、羅丹明123、苯酚紅、副品紅、中性紅、曙紅Y、橙黃Ⅱ、甲基橙、結(jié)晶紫幾乎沒有交叉反應(yīng)，而對(duì)RB的抑制率為100％。
　　3.ELISA檢測(cè)方法的

6、建立。
　　利用純化后的7F11單克隆抗體建立檢測(cè)RB殘留的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法。包被原最佳稀釋濃度1∶2000，純化后7F11抗體的工作濃度1∶64000，RB濃度在6～5000ng/mL時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)曲線線性良好，線性方程為y=0.3056x-0.2357(R2=0.9903)，IC50為254.5ng/L，LOD低于6ng/mL，LOQ為12.5ng/mL。
　　4.臘肉中RB添加回收實(shí)驗(yàn)
　　對(duì)臘肉進(jìn)行添加回收實(shí)驗(yàn)

7、，臘肉樣品需要經(jīng)過前處理后才能用于實(shí)驗(yàn)測(cè)定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示樣品處理液稀釋16倍以上時(shí)，樣品的基質(zhì)干擾基本消失。在12～5000ng/mL范圍內(nèi)，曲線標(biāo)準(zhǔn)方程:y=0.3372x-0.3620，相關(guān)系數(shù)R2=9913，IC50為359ng/mL，LOD低于12ng/mL，LOQ為23.4ng/mL。用50、300、800ng/mL的RB標(biāo)準(zhǔn)液做添加回收實(shí)驗(yàn)，經(jīng)檢測(cè)臘肉樣品回收率在82％～93％之間。
　　5.RB膠體金免疫層析試紙條的

8、研制
　　采用檸檬酸三鈉還原氯金酸方法制備了3種不同粒徑的膠體金，分別進(jìn)行顏色觀察和紫外掃描曲線，結(jié)果表明，31nm膠體金顆?？捎糜跇?biāo)記抗體。通過實(shí)驗(yàn)摸索確定了膠體金標(biāo)記抗體的最適pH為8.1，最適蛋白質(zhì)濃度為5.(3)μg/mL。利用實(shí)驗(yàn)室摸索的最佳條件制得免疫膠體金，采用低溫超速離心法進(jìn)行純化。金標(biāo)抗體最佳稀釋度選擇為1∶1.5，最佳噴涂量為30μL/cm。硝酸纖維素膜質(zhì)控線兔抗鼠IgG最佳噴量為0.7μL/cm，檢測(cè)線RB-