磺胺喹惡啉單克隆抗體的制備及酶聯(lián)免疫快速檢測方法的建立.pdf

1、磺胺喹惡啉(Sulfaquinoxaline，SQ)是一種高效抗球蟲劑和抗菌劑，主要用于治療家禽、反芻幼畜及小動物的球蟲病。養(yǎng)殖場為防治和治療動物疾病常在動物飼料或飲用水中加入磺胺喹惡啉，常導致畜禽急慢性中毒和畜禽制品的藥物殘留，人經常低劑量攝入含有磺胺喹惡啉殘留的動物源性食品，當它在體內富集達一定濃度時，可造成變態(tài)反應、過敏反應，甚至致畸、致癌作用。因此各國都比較重視其殘留的檢測問題，中國及歐盟、日本、美國等西方發(fā)達國家規(guī)定磺胺喹惡啉

2、殘留限量為100ng/g。目前，在藥殘檢測領域，免疫學分析方法因其操作簡便、快速、靈敏度高、特異性強、成本低、可實現(xiàn)批量檢測的優(yōu)勢已成為國內外研究熱點。本研究旨在建立磺胺喹惡啉殘留的酶聯(lián)免疫檢測(ELISA)方法，以方便養(yǎng)殖戶自檢，并為有效監(jiān)管磺胺喹惡啉的使用及殘留情況提供更好的研究依據(jù)。
　　 本研究依據(jù)磺胺喹惡啉與載體蛋白(BSA、OVA)的分子結構，采用重氮化法合成免疫原原BSA-SQ，進而制備單克隆抗體，最終成功研制出磺

3、胺喹惡啉直接競爭ELISA快速檢測試劑盒。主要研究成果如下：
　　 1.磺胺喹惡啉完全抗原的制備及鑒定
　　 分別用戊二醛(GA)法、碳二亞胺(EDC)法、重氮化法探索人工抗原BSA-SQ的制備，并用紫外掃描(UV)、SDS-PAGE電泳對其進行初步鑒定。結果表明：采用GA法與EDC法制得的BSA-SQ偶聯(lián)效果不理想，用重氮化法制備BSA-SQ效果較好。將重氮化法制備的人工抗原BSA-SQ免疫BALB/C小鼠，獲得了高價

4、、敏感的抗磺胺喹惡啉多克隆抗體(pAb)，確定重氮化法制備人工抗原BSA-SQ獲得成功。
　　 2.磺胺喹惡啉單克隆抗體的制備及免疫學特性的鑒定
　　 經BSA-SQ免疫產生多抗的BABL/C小鼠，用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)實驗篩選出細胞融合備用小鼠1只；超免后，將其脾細胞與NS0瘤細胞用PEG4000進行細胞融合，HAT培養(yǎng)液篩選培養(yǎng)；有限稀釋法進行3次克隆化，獲得了3株產磺胺喹惡啉單克隆抗體(mAb)的雜交瘤細

5、胞株1H8-B11、1H8-C6、1H8-F5；采用體內誘生腹水法大量生產后純化。經鑒定，1H8-B11、1H8-C6、1H8-F5細胞培養(yǎng)上清間接ELISA效價分別為1:1.92×102、1:1.92×102、1:3.84×102，腹水效價分別為1:2.0×105、1:2.0×105、1:2.56×105，親和力測定表明細胞株1H8-F5親和常數(shù)(Ka)最高，為4.19×109 L/moL，阻斷ELISA測定其SQ IC50為13.1

6、ng/mL，與磺胺氯吡嗪鈉的交叉反應率(CR)為20[％]，與其他同類化合物無CR。
　　 3.磺胺喹惡啉的酶聯(lián)免疫快速檢測方法的建立
　　 在制得SQ mAb的基礎上，依據(jù)直接競爭ELISA實驗原理，組裝制備了SQ殘留快速檢測直接競爭ELISA試劑盒(SQ-Kit)。SQ-Kit標準曲線回歸方程為y＝-0.262x＋0.6778，相關系數(shù)R2＝0.9786，SQ IC50為7.5ng/mL，檢測下限為5.0ng/mL。