沙丁胺醇單克隆抗體的制備及其免疫檢測方法的初步建立.pdf

1、沙丁胺醇(Salbutamol,Sal),又名舒喘寧,為選擇性β2受體激動劑。對動物具有促進骨骼肌(瘦肉)生長,減少脂肪蓄積等作用。常在豬、牛、雞等畜禽的生產(chǎn)中非法用作促生長劑,可提高飼料轉(zhuǎn)化率、增加瘦肉產(chǎn)量。但是,食品中沙丁胺醇的殘留能引起心悸、頭疼、目眩、呼吸困難,嚴重影響人們的健康。另外,檢測沙丁胺醇殘留的技術(shù)手段也相對滯后。因此,一些不法分子為謀取經(jīng)濟利益,在養(yǎng)殖場非法使用沙丁胺醇代替“瘦肉精”克倫特羅作為促生長劑。
　　

2、 目前,檢測沙丁胺醇的方法有氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)、高效液相色譜法(HPLC)、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(LC-MS)以及酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)等。GC-MS、HPLC和LC-MS方法準確可靠,但樣品前處理繁瑣,對儀器設(shè)備以及操作過程的要求較高,不適于生產(chǎn)、基層單位及現(xiàn)場檢測。ELISA檢測是一種基于抗原抗體反應和酶化學反應的檢測方法,具有快速、靈敏、操作簡單和一次檢測樣品量大的特點,而且不需要復雜昂貴的的儀器設(shè)備,對操

3、作者的專業(yè)要求也比較低。
　　 本實驗通過Sal與琥珀酸酐的醇解反應制備Sal的琥珀酸衍生物,用碳二亞胺法將Sal琥珀酸衍生物偶聯(lián)到載體蛋白牛血清白蛋白和卵清白蛋白上,合成為完全抗原Sal-HS-BSA和Sal-HS-OVA。通過紫外掃描(UV)和SDS-PAGE進行鑒定,確認沙丁胺醇已經(jīng)連接到載體蛋白上,偶聯(lián)比分別為7.7:1和8.8:1。用Sal-HS-BSA作為免疫原免疫BALB／C小鼠,間接ELISA方法檢測小鼠血清抗體

4、效價,抗體效價均達到了1:103-104。
　　 選擇免疫效果最好(抗體效價為1:2.56×104,IC50最低為270 ng／ml)的小鼠,取其脾細胞與SP2／0進行細胞融合,平均每孔有1-2株融合細胞生長,融合率為100％。經(jīng)陽性細胞亞克隆后,獲得6株雜交瘤細胞細胞株,分別測定其IC50,篩選出2株高效價、敏感、特異的雜交瘤細胞株,分別命名為2D9和1C4。將篩選得到的2D9和1C4雜交瘤細胞分別注射到成年Balb／c小鼠腹

5、腔,收集腹水,經(jīng)辛酸-硫酸銨法純化后,蛋白含量為3.6mg／ml,純度達78％-86％。經(jīng)間接ELISA效價檢測,2D9雜交瘤細胞株的細胞培養(yǎng)上清液和腹水抗體效價分別為1:2.56×104和1:4.096×106;1C4雜交瘤細胞株的細胞培養(yǎng)上清液和腹水抗體效價分別為1:1.28×104和1:2.048×105。經(jīng)抗體亞型鑒定,2D9和1C4細胞株所分泌的抗體均為IgG1。
　　 采用阻斷ELISA法測定抗Sal單克隆抗體的敏感

6、性和特異性。兩株抗體IC50值約為6.25 ng／ml,表明抗Sal單克隆抗體對Sal具有較高的敏感性。檢測抗Sal單克隆抗體與載體蛋白(BSA、OVA)、沙丁胺醇、鹽酸克倫特羅、萊克多巴胺、異丙腎上腺素和去甲腎上腺素的交叉反應性,根據(jù)交叉反應率(Cross reaction,CR)判定抗Sal單克隆抗體對鹽酸克倫特羅有26.09％的交叉反應性,對載體蛋白(BSA、OVA),萊克多巴胺等其它腎上腺激素類無交叉反應,說明所制備的抗Sal單

7、克隆抗體具有很高的特異性。
　　 本研究獲得了高效價、敏感、特異性的抗Sal抗體,并以抗單克隆抗體2D9為基礎(chǔ),初步確立了Sal殘留免疫學檢測方法,同時對相關(guān)條件如Sal-OVA包被條件、酶標抗體最佳使用濃度、酶標抗體最佳反應時間進行了優(yōu)化,應用間接競爭EIASA方法建立了檢測Sal殘留的標準曲線,曲線回歸方程為y=-32.595x+48.1(R2=0.9841),靈敏度和最低檢出限為別為1.14 ng／ml和0.15 ng／m