表達(dá)基因Ⅶ型新城疫病毒F或HN糖蛋白的重組馬立克氏病毒構(gòu)建及其免疫效力試驗(yàn).pdf

1、新城疫(Newcastle disease，ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)引起的一種高度接觸性傳染病，給世界養(yǎng)禽業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。當(dāng)前，Ⅶ型NDV是在中國(guó)、日本、韓國(guó)等地呈優(yōu)勢(shì)流行的基因型。由于常規(guī)NDV疫苗毒株與當(dāng)前流行的NDV毒株分屬于不同基因型，導(dǎo)致免疫雞群仍然時(shí)常發(fā)生非典型新城疫，因此有必要研制與流行株基因型匹配的新型疫苗。本研究以馬立克氏病病毒(Marek's disease

2、 virus，MDV)CVI988/Rispens疫苗毒株為載體，分別構(gòu)建表達(dá)基因Ⅶ型NDV主要保護(hù)性抗原F和HN蛋白的重組病毒，并對(duì)這兩株重組病毒的免疫保護(hù)效果進(jìn)行評(píng)價(jià)，為基因Ⅶ型NDV的防控提供新型疫苗。
　　為了使目的基因在重組MDV中高效表達(dá)，本研究首先對(duì)目的基因的啟動(dòng)子進(jìn)行了篩選。分別構(gòu)建含有Pec和CMV兩個(gè)啟動(dòng)子的綠色熒光蛋白(GFP)重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染DF1細(xì)胞，通過觀測(cè)熒光強(qiáng)度以及western-blot試驗(yàn)來判定兩

3、個(gè)啟動(dòng)子的活性，結(jié)果顯示CMV啟動(dòng)子的活性強(qiáng)于Pec啟動(dòng)子。
　　采用RT-PCR擴(kuò)增基因Ⅶ型NDV(DT-2014)的F和HN基因，并分別克隆入含有CMV啟動(dòng)子的pEASY TM-M1表達(dá)載體中，陽(yáng)性質(zhì)粒命名為pEASY-M1-F和pEASY-M1-HN。擴(kuò)增F、HN基因的表達(dá)盒與本室構(gòu)建的含有MDV CVI988/Rispens疫苗毒株sorf1/sorf2序列的pU/D質(zhì)粒連接，得到的轉(zhuǎn)移載體命名為pU/D-F、pU/D-H

4、N。將轉(zhuǎn)移載體pU/D-F和pU/D-HN分別與表達(dá)GFP的重組MDV(rMDV-GFP)的基因組共轉(zhuǎn)染雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)。通過有限稀釋的方法獲得不含GFP的能穩(wěn)定表達(dá)相對(duì)應(yīng)F、HN基因的重組病毒rMDV-F和rMDV-HN。對(duì)獲得的重組病毒rMDV-F和rMDV-HN進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、免疫印跡試驗(yàn)(Western-Blot)、間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)鑒定，確定新城疫病毒的F、HN基因在馬立克病毒中插入正確，且能夠穩(wěn)

5、定表達(dá)。
　　本研究還評(píng)價(jià)了rMDV-F以及rMDV-HN兩株重組病毒對(duì)基因Ⅶ型NDV強(qiáng)毒株DT-2014和MDV超強(qiáng)毒株RBIB的免疫保護(hù)效力。在重組病毒對(duì)NDV的免疫保護(hù)試驗(yàn)中，100只1日齡SPF雞隨機(jī)分成5組，依次為rMDV-F免疫組、rMDV-HN免疫組、弱毒疫苗免疫組、攻毒對(duì)照組以及空白對(duì)照組。前2組分別于1日齡頸部皮下接種5000噬斑形成單位(PFU)的rMDV-F或rMDV-HN重組病毒;弱毒疫苗組參照疫苗推薦劑量

6、在7日齡滴鼻點(diǎn)眼免疫LaSota弱毒疫苗，21日齡時(shí)對(duì)除空白對(duì)照組外的其余4組用105EID50的DT-2014毒株攻毒，攻毒后連續(xù)觀察7天，結(jié)果顯示攻毒對(duì)照組的死亡率為100％，同各免疫組之間的差異極顯著。重組病毒和弱毒疫苗均能在面臨NDV攻擊時(shí)對(duì)雞群提供有效的保護(hù)，其中rMDV-F免疫組的保護(hù)率為85％，rMDV-HN免疫組的保護(hù)率為80％，弱毒疫苗免疫組的保護(hù)率為90％;針對(duì)各組免疫后抗體增長(zhǎng)的檢測(cè)結(jié)果顯示兩個(gè)重組病毒免疫組自免疫