NDV7793-HN蛋白在SF9細(xì)胞中的表達(dá).pdf

1、研究背景及目的:新城疫病毒(NDV)屬于禽類病毒，能引起禽類大面積的死亡，給家禽業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。NDV病毒對(duì)人類基本不致病，但能殺死腫瘤細(xì)胞，已被用于抗腫瘤的生物治療上。2006年以來課題組利用從江西省鄱陽湖野鴨分離得到的1株NDV7793弱毒株進(jìn)行NDV抗腫瘤治療的系列研究，積累了大量NDV抗腫瘤生物治療基礎(chǔ)研究的經(jīng)驗(yàn)。為了能更深入進(jìn)行研究，擬利用真核表達(dá)基因工程系統(tǒng)對(duì)NDV的表面蛋白進(jìn)行表達(dá)和純化。
　　NDV含有多種蛋

2、白，其中的血凝素神經(jīng)氨酸酶蛋白(HN)是固定在病毒囊膜外表面上的蛋白，具有血凝素和神經(jīng)氨酸酶的功能，在病毒侵染細(xì)胞的過程中，HN起到識(shí)別細(xì)胞膜表面的唾液酸受體和介導(dǎo)病毒吸附細(xì)胞膜的作用。HN不僅是NDV引起禽類致病的主要蛋白，而且在NDV發(fā)揮抗腫瘤功能上起至關(guān)重要的作用，研究HN蛋白的功能有重要意義。為了獲得高品質(zhì)的HN蛋白進(jìn)行深入的研究，將利用昆蟲細(xì)胞——草地貪夜蛾卵巢細(xì)胞系(SF9)來表達(dá)NDV7793HN蛋白，這是實(shí)驗(yàn)室第一次利用

3、SF9細(xì)胞表達(dá)NDV7793弱毒株的HN蛋白。
　　方法:
　　1.提取NDV7793的RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，通過PCR將HN基因進(jìn)行點(diǎn)突變，并將NcoⅠ/XhoⅠ酶切位點(diǎn)引入NDV7793HN基因片段。
　　2.將HN基因片段通過酶切和連接的方法連接到pFastBac1 HT B質(zhì)粒載體，以構(gòu)建pFastBac1 HT B-HN重組質(zhì)粒，將質(zhì)粒送測序公司進(jìn)行測序。
　　3.將測序正確的pFastBac1 H

4、T B-HN重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞DH10Bac TM中，提取H N桿粒，PCR驗(yàn)證HN桿粒。
　　4.用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑將HN桿粒轉(zhuǎn)入進(jìn)昆蟲SF9細(xì)胞中，培養(yǎng)48小時(shí)后收取細(xì)胞培養(yǎng)上清，獲得第一代病毒，接著用一代病毒感染SF9細(xì)胞，培養(yǎng)60小時(shí)后收取細(xì)胞培養(yǎng)上清，獲得二代病毒，最后用二代病毒感染SF9細(xì)胞，培養(yǎng)72小時(shí)后收集細(xì)胞，用SDS-PAGE檢測HN蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1.從NDV7793病毒中提取出

5、了病毒的RNA，RNA逆轉(zhuǎn)錄成了cDNA，PCR擴(kuò)增出1710bp帶有NcoⅠ/XhoⅠ酶切位點(diǎn)的HN基因片段。
　　2.測序結(jié)果表明:pFastBac1 HT B-HN質(zhì)粒構(gòu)建成功，HN中的XhoⅠ酶切位點(diǎn)被去除。
　　3.從DH10BacTM細(xì)胞其取出HN桿粒，PCR驗(yàn)證HN桿粒構(gòu)建成功。
　　4.SDS-PAGE結(jié)果顯示在HN桿粒感染的SF9細(xì)胞裂解液中比未感染病毒的SF9細(xì)胞裂解液在67kDa左右出現(xiàn)了一個(gè)明顯