河南部分地區(qū)NDV分子流行病學(xué)研究及NDV HN主要抗原區(qū)蛋白在抗體檢測(cè)中的應(yīng)用.pdf

1、新城疫（ND）是由新城疫病毒（NDV）引起的具有高度傳染性的家禽傳染病，給世界各國(guó)的養(yǎng)禽業(yè)帶來(lái)嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。隨著NDV疫苗的廣泛應(yīng)用，ND的流行雖得到控制，但是其流行趨勢(shì)卻在發(fā)生變化，如非典型性ND、病毒新基因型出現(xiàn)和致病性宿主范圍擴(kuò)大等給臨床ND的防控來(lái)帶很大困難。HN蛋白是位于NDV囊膜表面的一種主要結(jié)構(gòu)蛋白、病毒保護(hù)性抗原之一，它在抗原性的決定等方面具有重要作用。本研究在分析河南部分地區(qū)NDV分子流行病學(xué)的基礎(chǔ)上，利用原核表達(dá)系

2、統(tǒng)獲得了新鄉(xiāng)地區(qū)致病株ND xx08株HN主要抗原區(qū)重組蛋白，利用純化的重組HN蛋白建立檢測(cè)ND抗體的間接ELISA方法。
　　通過(guò)雞胚接種病毒收獲尿囊液，血凝（HA）及血凝抑制（HI）試驗(yàn)檢測(cè)其血凝活性，利用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增NDV F蛋白裂解位點(diǎn)處重要功能區(qū)基因片段，同時(shí)進(jìn)行序列測(cè)定，構(gòu)建NDV遺傳進(jìn)化樹(shù)，分析其遺傳關(guān)系。結(jié)果顯示從發(fā)病死亡雞體內(nèi)分離到6株具有血凝活性的NDV，遺傳進(jìn)化分析表明：6株NDV分離株均屬Class

3、Ⅱ、基因Ⅶ型，F(xiàn)蛋白裂解位點(diǎn)處氨基酸序列為112RRQKRF117，具有典型的強(qiáng)毒株特征，F(xiàn)蛋白氨基酸同源性在82.5％-97.6％之間。
　　在上述流行病學(xué)的基礎(chǔ)上，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增出流行毒株NDV HN主要抗原區(qū)基因片段，將目的基因片段克隆于 pMD18-T-vector載體，構(gòu)建重組克隆質(zhì)粒命名為pMD-rHN，經(jīng) PCR、雙酶切和測(cè)序鑒定正確后，回收目的基因，將目的基因克隆于原核表達(dá)載體pET-28a(+)，構(gòu)建重組表達(dá)

4、質(zhì)粒，命名為pET28a-rHN。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，優(yōu)化表達(dá)條件，SDS-PAGE和Western-blot鑒定表達(dá)產(chǎn)物。擴(kuò)大誘導(dǎo)培養(yǎng)，超聲破碎收集菌體，采用Ni-NTA親和樹(shù)脂進(jìn)行純化。結(jié)果顯示，IPTG濃度在0.2mmol/L，30℃誘導(dǎo)4h目的蛋白獲得高效表達(dá)，其分子量為28KDa，可溶性分析表明重組蛋白以包涵體的形式存在。Western-blotting鑒定結(jié)果顯示，重組蛋白能夠與雞NDV高免血清發(fā)生反應(yīng)，經(jīng)Ni-NTA親和樹(shù)

5、脂進(jìn)行純化后，得到濃度為0.8 mg/mL的重組蛋白。
　　以純化的HN重組蛋白為包被抗原建立了檢測(cè)NDV血清抗體的間接ELISA檢測(cè)方法。優(yōu)化ELISA工作條件，確定抗原最適包被濃度為5μg/mL，血清最適稀釋比例為1:80，其最佳反應(yīng)時(shí)間為40min，酶標(biāo)二抗最佳工作濃度為1:1000，其最佳反應(yīng)時(shí)間為30min，以X+3SD=0.220作為陰、陽(yáng)性血清判定的臨界值。與HI試驗(yàn)比較其特異性為92.85％，敏感性為91.2％，準(zhǔn)