三種鋅指蛋白在NDV、AIV感染中作用的初探.pdf

1、先天性抗病毒因子在機(jī)體抗病毒感染的免疫應(yīng)答過程中起著重要作用，是當(dāng)前抗病毒免疫研究的熱點(diǎn)問題。研究表明，鋅指蛋白也是一種先天性抗病毒因子，在機(jī)體的免疫系統(tǒng)扮演著重要角色。鋅指蛋白可以調(diào)節(jié)細(xì)胞因子如白細(xì)胞介素、干擾素的表達(dá)，并直接調(diào)控淋巴細(xì)胞的生長和分化。在先天免疫應(yīng)答過程中，鋅指蛋白直接或間接發(fā)揮抗病毒作用。盡管如此，在禽類上鋅指蛋白的研究幾乎是一片空白，對其結(jié)構(gòu)和功能一無所知。如果能通過研究禽鋅指蛋白的功能，篩選到一些在抗感染免疫中發(fā)

2、揮重要功能的鋅指蛋白，將可能為新藥的開發(fā)或禽類疫病的防控提供新的思路，因此我們開展了以下幾方面內(nèi)容的研究。
　　1)新城疫病毒感染對多種雞源鋅指蛋白表達(dá)的影響
　　在前期研究中，本實(shí)驗(yàn)室通過高通量測序獲得了NDV感染CEF細(xì)胞后鋅指蛋白的表達(dá)譜。在此基礎(chǔ)上，本研究篩選了10種在病毒感染后表達(dá)量發(fā)生明顯變化的鋅指蛋白進(jìn)行后續(xù)研究。依據(jù)GenBank預(yù)測的鋅指蛋白基因序列，首先初步設(shè)計(jì)了檢測鋅指蛋白mRNA水平的RT-qPCR引

3、物，對NDV感染DF-1細(xì)胞中10種鋅指蛋白表達(dá)量的變化情況進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，chZC3 HAV1、chZC3H6和chZEB1三種鋅指蛋白在病毒感染后表達(dá)下調(diào)，在后期又明顯的上調(diào)，說明這三種鋅指蛋白可能參與了病毒感染過程。隨后，我們從CEF細(xì)胞的cDNA樣品中擴(kuò)增出上述三種鋅指蛋白的完整基因序列并進(jìn)行生物信息學(xué)分析。雞的chZC3HAV1、chZC3H6與其他禽類的同源基因親源性較近，其次是爬行動物，而與哺乳動物親源性最低，而雞的c

4、hZEB1蛋白在進(jìn)化上與其他禽類哺乳動物、爬行動物的親源性都很高，這說明ZEB1在進(jìn)化上非常保守。結(jié)構(gòu)域預(yù)測結(jié)果顯示雞源ZC3HAV1、ZC3H6和ZEB1蛋白具有和人源蛋白類似的功能結(jié)構(gòu)域，其鋅指結(jié)構(gòu)在進(jìn)化上是相對保守的，推測雞源和人源鋅指蛋白具有相似的功能。
　　2)雞鋅指蛋白chZC3HAV1、chZC3H6和chZEB1的抗病毒功能的初步鑒定
　　為了確認(rèn)chZC3HAV1、chZC3H6和chZEB1是否參與病毒感

5、染后宿主細(xì)胞的抗感染免疫應(yīng)答過程，本研究對上述三種鋅指蛋白的抗病毒功能進(jìn)行了初步鑒定。首先，通過已經(jīng)獲得的chZC3HAV1、chZC3H6和chZEB1基因序列對qPCR檢測引物和體系進(jìn)行優(yōu)化，最終獲得了靈敏性高、特異性好、分別針對三種鋅指蛋白的RT-qPCR檢測方法。在對多種細(xì)胞和雞組織臟器中的鋅指蛋白進(jìn)行定量檢測，發(fā)現(xiàn)三種鋅指蛋白廣泛表達(dá)于雞的組織細(xì)胞中，脾臟和法氏囊中的表達(dá)量都相對較高。病毒感染試驗(yàn)結(jié)果顯示，在NDV感染中后期，

6、chZC3HAV1、chZEB1表達(dá)量大幅上升;AIV感染能強(qiáng)有力刺激chZC3HAV1的上調(diào)表達(dá)。過表達(dá)chZEB1實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，chZEB1不能抑制NDV的增殖，說明chZEB1可能并不直接參與抗感染的免疫應(yīng)答，有可能是參與特異性免疫應(yīng)答過程中。過表達(dá)chZC3HAV1發(fā)現(xiàn)，chZC3HAV1對NDV的增殖抑制能力不強(qiáng)，卻能夠有限抑制AIV的增殖。
　　3) chZC3HAV1抑制病毒增殖的機(jī)制研究
　　本研究對chZC

7、3HAV1抗病毒功能做了更進(jìn)一步的研究。首先，通過過表達(dá)chZC3HAV1，我們發(fā)現(xiàn)chZC3HAV1具有很強(qiáng)的抗AIV作用而對NDV抗病毒能力較弱。通過比較AIV和NDV感染后細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)中chZC3HAV1的表達(dá)，我們發(fā)現(xiàn)NDV不能在感染早期誘導(dǎo)chZC3HAV1的基因上調(diào)，而整個(gè)AIV感染過程中，chZC3HAV1表達(dá)量一直上調(diào)。后續(xù)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了這一現(xiàn)象，NDV感染早期，雞組織臟器中的chZC3HAV1表達(dá)量并未出現(xiàn)明顯上調(diào)。

8、由于chZC3HAV1是一種早期抗病毒因子，推測NDV感染后chZC3HAV1表達(dá)的滯后是其不能有效發(fā)揮抗NDV作用的因素之一。本研究進(jìn)一步研究了chZC3HAV1的抗病毒機(jī)制。通過雙熒光素酶檢測系統(tǒng)，我們發(fā)現(xiàn)過表達(dá)chZC3HAV1不能激活NF-κB、IRF-3/7、IFN-β等信號通路，間接證明chZC3HAV1并不能和人源ZC3HAV1基因一樣，通過與RIG-Ⅰ的相互作用增強(qiáng)干擾素信號，這表明雞天然缺失RIG-Ⅰ造成了部分先天性免