應(yīng)用Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)體系在sf9細(xì)胞中重組表達(dá)保守性多巴胺能神經(jīng)營養(yǎng)因子.pdf

1、目的:應(yīng)用bac-to-bac桿狀病毒表達(dá)體系在sf9昆蟲細(xì)胞中表達(dá)重組CDNF蛋白。
　　方法:應(yīng)用Trizol法提取小鼠組織總RNA,RT-PCR擴(kuò)增得到小鼠CDNF基因全長(564bp)片段,將CDNF基因插入至轉(zhuǎn)座載體pFastBacHTb中,構(gòu)建重組質(zhì)粒pFastBacHTb-CDNF,然后轉(zhuǎn)化到E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞中,以LB/Amp平板篩選陽性重組子,并經(jīng) PCR、酶切及測序驗(yàn)證以保證重組載體的正確及可靠性

2、;將桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pFasBacHTb-CDNF轉(zhuǎn)化到DH10Bac E.coli(自帶桿粒及輔助質(zhì)粒)感受態(tài)細(xì)胞中,通過轉(zhuǎn)座作用將目的片段整合到桿粒中,抗性及藍(lán)白斑篩選法篩選出重組桿狀病毒載體 Bacmid-CDNF,使用 CDNF特異引物及PUC/M13桿粒測序引物對重組桿粒進(jìn)行驗(yàn)證;參照CELLFECTINⅡ脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染劑操作說明,將重組Bacmid-CDNF桿粒轉(zhuǎn)染sf9昆蟲細(xì)胞,并在光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化,以判斷轉(zhuǎn)染的

3、成功性;轉(zhuǎn)染成功后,收集P1代病毒液,繼續(xù)感染sf9細(xì)胞,可獲取P2代和P3代病毒液,應(yīng)用P3代病毒誘導(dǎo)重組CDNF蛋白的表達(dá),并應(yīng)用Western blot對重組蛋白的表達(dá)進(jìn)行驗(yàn)證。
　　結(jié)果:(1)RT-PCR結(jié)果經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳顯示,成功獲取564bp大小的CDNF目的基因片段,重組質(zhì)粒 pFastBacHTb-CDNF經(jīng)PCR、酶切及基因測序驗(yàn)證均正確無誤;(2)重組轉(zhuǎn)移載體pFastBacHTb-CDNF轉(zhuǎn)化DH10Ba

4、c感受態(tài)細(xì)胞后,陽性bacmid-CDNF重組子經(jīng)CDNF特異引物及pUC/M13桿粒測序引物PCR驗(yàn)證可分別獲取561bp及3000bp大小目的片段,均與理論大小相符,表明桿粒構(gòu)建成功;(3)重組桿粒通過Cellfectin轉(zhuǎn)染劑轉(zhuǎn)染sf9昆蟲細(xì)胞,轉(zhuǎn)染48~72后,sf9細(xì)胞細(xì)胞直徑逐漸增大,細(xì)胞漸脫離貼壁培養(yǎng)狀態(tài),隨之,細(xì)胞漸漸腫脹,種種跡象均表明,桿粒轉(zhuǎn)染成功,收獲桿狀病毒液;(4)P3代桿狀病毒液感染sf9細(xì)胞,誘導(dǎo)重組CDN