蝙蝠SARS樣冠狀病毒Spike蛋白受體結(jié)合域在Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá).pdf

1、目的：
　　 SARS冠狀病毒表面的刺突蛋白(Spike，S蛋白) 可與宿主細(xì)胞上的病毒受體血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2(Angiotensin-converting enzyme 2,ACE2)結(jié)合，介導(dǎo)病毒進(jìn)入細(xì)胞。S蛋白上的受體結(jié)合功能域（Receptor Binding Domain，RBD）是能與ACE2穩(wěn)定結(jié)合的最小功能片段，在病毒的跨宿主傳播中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。
　　 在SARS冠狀病毒溯源的研究中，研究人員在蝙蝠體內(nèi)

2、發(fā)現(xiàn)SARS樣冠狀病毒（Bat SARS-LcoV），但由于Bat SARS-LCoV不能在現(xiàn)有的細(xì)胞培養(yǎng)體系中有效擴(kuò)增和分離，限制了直接利用活病毒對(duì)細(xì)胞或動(dòng)物模型感染從而進(jìn)行跨宿主傳播機(jī)制的研究工作。本研究利用桿狀病毒-昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)對(duì)蝙蝠SARS樣冠狀病毒（Bat SARS-LcoV）S蛋白的RBD片段進(jìn)行融合表達(dá)，并初步探索其表達(dá)動(dòng)力學(xué)和純化條件，旨在為進(jìn)一步研究Bat SARS-Like-CoV在動(dòng)物間的傳播路線和跨種屬傳播機(jī)

3、制提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，亦為進(jìn)一步研究Bat SL-CoV S蛋白的抗原性和免疫原性提供基礎(chǔ)材料。
　　 方法：
　　 1、pFAST-Bat-RBD供體質(zhì)粒的構(gòu)建：以蝙蝠SARS樣病毒S蛋白基因第964-1542位核苷酸為目的片段設(shè)計(jì)引物，在反向引物上引入FLAG融合蛋白標(biāo)簽，通過(guò)PCR獲取大量目的基因，并通過(guò)T-A克隆連接到pMD18-T載體，再通過(guò)亞克隆手段將目的基因正確插入到pFAST-HTB的多克隆位點(diǎn)，以構(gòu)建出pFA

4、ST-Bat-RBD重組供體質(zhì)粒。
　　 2、重組桿狀病毒的產(chǎn)生和滴度測(cè)定：以重組供體質(zhì)粒pFAST-BAT-RBD轉(zhuǎn)化E.Coli DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞，可使其所帶的目的基因BAT-RBD與E.Coli DH10Bac細(xì)胞內(nèi)的桿狀病毒基因組（Bacmid）發(fā)生轉(zhuǎn)座重組。將重組的桿狀病毒基因組Bacmid-BAT-RBD轉(zhuǎn)染sf9昆蟲細(xì)胞，即可產(chǎn)生重組的桿狀病毒。通過(guò)檢測(cè)病毒的半數(shù)致死計(jì)量（TCID50），確定病毒的滴度。<

5、br>　　 3、重組蛋白BAT-S-RBD的產(chǎn)生和鑒定：用高滴度的病毒液以合適的感染復(fù)數(shù)（MOI）感染昆蟲細(xì)胞，72小時(shí)后收集細(xì)胞和培養(yǎng)上清液作SDS-PAGE及Western Blot檢測(cè)以明確蛋白表達(dá)的定位。并對(duì)重組蛋白的表達(dá)作時(shí)間和MOI優(yōu)化，通過(guò)鎳離子螯合樹脂純化重組蛋白。
　　 結(jié)果：
　　 1、質(zhì)粒pFAST-Bat-RBD經(jīng)雙酶切、PCR鑒定和基因測(cè)序，結(jié)果證實(shí)克隆的目的基因正確插入到供體質(zhì)粒，其序列與

6、蝙蝠SARS樣病毒S蛋白基因964-1542片段完全吻合，提示供體質(zhì)粒pFAST-Bat-RBD構(gòu)建成功。
　　 2、重組桿狀病毒基因組Bacmid-BAT-RBD的PCR檢測(cè)結(jié)果表明，目的基因已正確插入到桿狀病毒基因組中；細(xì)胞轉(zhuǎn)染桿狀病毒基因組后產(chǎn)生典型病變，以及稀釋的培養(yǎng)上清液能使正常細(xì)胞產(chǎn)生相同病變，表明重組病毒成功產(chǎn)生；通過(guò)測(cè)定病毒的半數(shù)致死計(jì)量（TCID50），得出P1病毒的濃度為8.6×106 PFU/ml，P2病毒

7、液的濃度為5.3×107 PFU/ml，P3病毒液的濃度為2.1×108 PFU/ml。
　　 3、SDS-PAGE及Western Blot檢測(cè)結(jié)果表明，昆蟲細(xì)胞感染重組桿狀病毒后，成功產(chǎn)生了重組蛋白BAT-S-RBD，其分子量約26kDa，且重組蛋白只在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，并不能分泌到培養(yǎng)基中。重組蛋白表達(dá)的最適合MOI為2；表達(dá)峰值在感染病毒56小時(shí)到64小時(shí)之間；可通過(guò)鎳離子螯合樹脂純化重組蛋白。
　　 結(jié)論：