偽狂犬病病毒感染誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞動(dòng)態(tài)學(xué)變化的研究.pdf

1、豬偽狂犬病(Aujeszky's disease)最早發(fā)現(xiàn)于美國，在1920到1940年間呈世界性散在發(fā)生，并且在之后30年間呈爆發(fā)性，其發(fā)病率明顯增加。目前，豬偽狂犬病在我國仍然是威脅養(yǎng)豬業(yè)的重要疾病之一。
　　偽狂犬病病毒(Pseudorabies Virus，PRV)屬于皰疹病毒科病毒，為有囊膜的雙鏈DNA病毒。PRV感染動(dòng)物后可以沿著感染部位附近外周神經(jīng)復(fù)制移行，逐漸進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)，導(dǎo)致腦組織發(fā)生病變。研究偽狂

2、犬病病毒誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞(microglia)動(dòng)態(tài)變化及microglia動(dòng)態(tài)變化對疾病發(fā)展進(jìn)程的影響具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)主要通過建立PRV人工感染小鼠模型，研究偽狂犬病病毒感染誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞動(dòng)態(tài)學(xué)變化。實(shí)驗(yàn)采用PRV-Bartha K61疫苗株皮下人工感染小鼠，使用6×104TCID50、1×105TCID50以及2.7×105TCID50三組劑量作為人工感染劑量。三組劑量均在人工感染后6d導(dǎo)致小鼠出現(xiàn)死亡，小鼠存活率分別為93％、

3、93％和85％。然而在人工感染后第7d，小鼠存活率差異顯著，6×104 TCID50劑量實(shí)驗(yàn)組存活率無變化，而另外兩組分別降至67％及14％。各劑量組人工感染后均導(dǎo)致小鼠大腦及腦干出現(xiàn)病變，其病變程度與人工感染劑量呈正相關(guān)。1×105TCID50劑量實(shí)驗(yàn)組既能使小鼠保持較高的存活率，又可導(dǎo)致明顯的腦組織病變，所以采用其為后續(xù)實(shí)驗(yàn)人工感染劑量。通過免疫組織化學(xué)染色，激光共聚焦及流式細(xì)胞術(shù)分析PRV感染誘導(dǎo)的microglia動(dòng)態(tài)變化。用增

4、殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)抗體和microglia及巨噬細(xì)胞特異性蛋白抗體Iba1(ionized calcium binding adapter molecule1)標(biāo)記增殖的microglia，用Iba1免疫組化染色方法觀察microglia細(xì)胞形態(tài)。結(jié)果顯示，PRV感染后大腦組織中出現(xiàn)增殖的microglia．其形態(tài)由靜息狀態(tài)(Resting)轉(zhuǎn)化為活化狀態(tài)(Ac

5、tivated)。應(yīng)用5-溴脫氧尿嘧啶核苷(5-bromo-deoxy-uridine，BrdU)示蹤技術(shù)，證明microglia非原位增殖。通過用G蛋白偶合受體激酶1(Gr1)抗體，抗中性粒細(xì)胞表面抗原Ly6G抗體及抗單核細(xì)胞表面抗原Ly6C抗體，經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)分析增殖microglia的表型特征，結(jié)果顯示增殖microglia為CD11 b+CD45hiGrl+Ly6G-Ly6Chi，證明其來源于外周血炎癥性單核細(xì)胞。通過Semi-q