微囊化轉(zhuǎn)重組hIL-10基因細胞株的構(gòu)建.pdf

1、Ⅰ型糖尿病是目前嚴重危害人類健康的常見病、多發(fā)病，全世界約有2％-5％的人患有此種疾病，且呈逐年增長趨勢，多見于兒童和青少年。從降糖藥物到胰島素，從胰腺移植到胰島移植，Ⅰ型糖尿病的治療經(jīng)歷了一個漫長的過程。而目前微囊化胰島移植是糖尿病治療的研究熱點。由于微囊化技術(shù)的應(yīng)用，在很大程度上解決了移植過程中的免疫排斥問題。然而小分子的炎癥因子仍然能夠透過微囊對移植物造成損害，最終導致胰島死亡。 IL-10是一種35～40kD的酸性蛋白，

2、由兩個同源的亞基組成．它具有抗炎和抑制多種細胞因子合成的作用，所以稱之為細胞因子合成抑制因子(CytokineSyntllesis Inhibiting Factor，CSIF)。目前很多實驗證明IL-10具有抗炎癥活性和免疫抑制活性，為一種潛在的免疫增殖反應(yīng)和炎癥反應(yīng)的負性調(diào)節(jié)因子，是針對器官移植的良性細胞因子。 基于上述原因，本研究通過構(gòu)建穩(wěn)定表達hIL-10的基因工程細胞株并將其微囊化，把hIL-10與微囊技術(shù)結(jié)合起來應(yīng)用

3、于胰島移植治療糖尿病的研究。 方法： (1)制備微包囊，并對其性能進行檢測。(2)從人外周血淋巴細胞中克隆hIL-10基因，在其5端添加鼠白蛋白信號肽核酸序列，將這段cDNA插入pcDNA3，構(gòu)建hIL-10基因真核表達載體。(3)脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染c2c12細胞，經(jīng)過G418藥物篩選，挑單克隆得到了穩(wěn)定表達hIL-10的c2c12/hIL-10細胞株，(4)c2c12/hIL-10細胞株微囊化制得微囊化基因工程細胞，觀察微囊化c2c

4、12/hIL-10細胞在體外的生長，并檢測培養(yǎng)上清中hIL-10的分泌情況。 結(jié)果： (1)微囊在機械強度，生物相容性，以及通透性方面均達到了移植的要求；(2)將真核表達載體進行測序，序列分析結(jié)果表明鼠白蛋白信號肽核苷酸序列的同源性達到96％，hIL-10核苷酸序列同源性為100％，并且讀碼框正確都為相同的氨基酸編碼；(3)基因轉(zhuǎn)染數(shù)周后，在RNA水平上檢測到hIL-10基因；免疫組織化學檢測到hIL-10蛋白表達，wester

5、n blot檢測到細胞培養(yǎng)上清液中有hIL-10蛋白表達分泌；(4)把c2c12/hIL-10細胞包微囊，western blot檢測hIL-10能分泌到微囊外，MTT檢測微囊化基因工程細胞體外增殖情況，結(jié)果表明微囊化并沒有抑制細胞的增殖，只是在細胞增殖的起始階段出現(xiàn)滯后。 結(jié)論：正確的構(gòu)建了hIL-10基因真核表達載體，并且得到了穩(wěn)定表達hIL-10的c2c12/hIL-10細胞株， c2c12/hIL-10細胞微囊化后細胞在