ST3GAL家族和ST6GALNAC家族在人慢性粒細(xì)胞白血病多藥耐藥中的作用.pdf

1、目的:
　　通過研究ST3GAL和ST6GALNAC家族在三對人慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞株及慢性粒細(xì)胞白血病患者外周血單個核細(xì)胞中的差異表達(dá)，明確ST3GAL和 ST6GALNAC家族與人慢性粒細(xì)胞白血病多藥耐藥的相關(guān)性，并且研究miR-4701-5p以ST3GAL1作為靶點和miR-4299以ST6GALNAC4為靶點對人慢性粒細(xì)胞白血病多藥耐藥的影響，從而為預(yù)測和診斷慢性粒細(xì)胞白血病多藥耐藥性，尋求逆轉(zhuǎn)藥物提供新策略和靶點。

2、>　　方法:
　　(1)采用real-time PCR技術(shù)和western-blot技術(shù)檢測三對人慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞株及慢性粒細(xì)胞白血病患者外周血單個核細(xì)胞中的ST3GAL和ST6GALNAC家族的表達(dá)情況，篩選出具有差異表達(dá)ST基因。
　　(2)特異性下調(diào)、上調(diào)差異表達(dá)的ST3GAL1基因和ST6GALNAC4基因，檢測干擾、過表達(dá)前后KCL22/ADR、KCL22細(xì)胞在體內(nèi)、體外對化療藥物敏感性的變化。
　　(3

3、)采用real-time PCR檢測三對化學(xué)敏感和化學(xué)耐藥的人慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞株和臨床慢性粒細(xì)胞白血病患者外周血單個核細(xì)胞中miR-4701-5p和miR-4299的表達(dá)變化。miR-4701-5p的模擬物(100nM)轉(zhuǎn)染到KCL22細(xì)胞中，將miR-4701-5p的拮抗劑轉(zhuǎn)染到KCL22/ADR細(xì)胞中，然后檢測ST3GAL1表達(dá)的變化。將miR-4299的模擬物(100nM)轉(zhuǎn)染到KCL22/ADR細(xì)胞中，將miR-4299的拮

4、抗劑轉(zhuǎn)染到KCL22細(xì)胞中，然后對ST6GALNAC4表達(dá)的變化進(jìn)行檢測。將ST3GAL1和ST6GALNAC4的3'-UTR的靶基因序列(wt3'-UTR)和ST3GAL1和ST6GALNAC4的突變基因序列(mt3'-UTR)克隆到熒光素酶報告基因載體，然后將wt3'-UTR或mt3'-UTR載體和miR-4701-5p模擬物轉(zhuǎn)染到KCL22細(xì)胞中以及miR-4299模擬物轉(zhuǎn)染到KCL22/ADR細(xì)胞中，進(jìn)行熒光素酶活性檢測。

5、>　　(4)將miR-4701-5p的模擬物轉(zhuǎn)染到KCL22細(xì)胞中，而miR-4701-5p的拮抗劑轉(zhuǎn)染到KCL22/ADR細(xì)胞中，將miR-4299的模擬物轉(zhuǎn)染到KCL22/ADR細(xì)胞中，而miR-4299的拮抗劑轉(zhuǎn)染到KCL22細(xì)胞中，檢測化學(xué)藥物阿霉素、紫杉醇和長春新堿的IC50值，用以研究miR-4701-5p和miR-4299是否可以在體外調(diào)節(jié)CML細(xì)胞的藥物敏感性。將轉(zhuǎn)染了miR-4701-5p的激活劑、miR-4701-5

6、p的拮抗劑、miR-4299的激活劑、miR-4299的拮抗劑和陰性對照的KCL22細(xì)胞和KCL22/ADR細(xì)胞接種到裸鼠體內(nèi)，測量小鼠腫瘤體積;qRT-PCR和western blotting方法檢測腫瘤組織中ST3GAL1、ST6GALNAC4、miR-4701-5p和miR-4299的表達(dá)情況。
　　第一部分結(jié)果:
　　(1)ST3GAL2和ST3GAL3在KCL22、K562和KU812細(xì)胞中的表達(dá)與其阿霉素耐藥細(xì)胞

7、株的表達(dá)在統(tǒng)計學(xué)上無明顯差異;ST3GAL1和ST3GAL5在三種藥物敏感的親本細(xì)胞株中基因及蛋白的表達(dá)明顯增高（*P＜0.05）;ST3GAL4在三種耐藥細(xì)胞系中呈現(xiàn)高表達(dá)（*P＜0.05）;而ST3GAL6在三對慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞株中無表達(dá)。
　　(2)ST3GAL4在CML/MDR患者外周血單個核細(xì)胞中呈高表達(dá)（*P＜0.05）;ST3GAL1和ST3GAL5在CML組中呈高表達(dá)（*P＜0.05）;ST3GAL2和ST3G

8、AL3的表達(dá)在兩組中無明顯差異;ST3GAL6在兩組中表達(dá)量較低。
　　(3)干擾ST3GAL1后的KCL22細(xì)胞株在mRNA和蛋白水平上的表達(dá)均顯著降低，作用于KCL22-ST3GAL1 shRNA1細(xì)胞的抗腫瘤藥物的IC50值明顯高于對照組。未經(jīng)阿霉素治療的小鼠在第21天到第28天期間，可以觀察到注射KCL22-ST3GAL1 shRNA1的小鼠平均瘤體積(891±92 mm3)顯著高于shRNA對照組(585±62 mm3，

9、*P＜0.05)。在經(jīng)阿霉素治療的小鼠中亦存在相同的現(xiàn)象。
　　(4)特異性上調(diào)ST3GAL1后，作用于KCL22/ADR/ST3GAL1細(xì)胞的抗腫瘤藥物的IC50值明顯低于KCL22/ADR/mock細(xì)胞的IC50值。小鼠在注射KCL22/ADR/ST3GAL1后的平均瘤體積明顯低于注射KCL22/ADR/mock的小鼠。給小鼠注射同樣的KCL22/ADR/ST3GAL1，經(jīng)過阿霉素治療的小鼠平均瘤體積明顯小于未經(jīng)過阿霉素治療的

10、小鼠。
　　(5)MiR-4701-5p的表達(dá)量在KCL22、K562和KU812細(xì)胞和慢性粒細(xì)胞白血病患者外周血單個核細(xì)胞中顯著下降，而ST3GAL1在化學(xué)敏感細(xì)胞株及藥物敏感患者的細(xì)胞中表達(dá)是升高的。轉(zhuǎn)染了模擬物的KCL22細(xì)胞中ST3GAL1的mRNA及蛋白的表達(dá)量明顯下降，在轉(zhuǎn)染了miR-4701-5p拮抗劑的KCL22/ADR細(xì)胞中，ST3GAL1的mRNA及蛋白的表達(dá)量明顯上升。轉(zhuǎn)染了wt3'-UTR載體的KCL22細(xì)

11、胞中miR-4701-5p表達(dá)的熒光素酶活性明顯下降，但是此結(jié)果可以被mtST3GAL1逆轉(zhuǎn)。
　　(6)MiR-4701-5p的高表達(dá)可顯著抑制KCL22細(xì)胞對化學(xué)藥物的敏感性，阿霉素、紫杉醇和長春新堿的IC50值升高。同時，在KCL22/ADR細(xì)胞中miR-4701-5p被拮抗劑所抑制后，可觀察到這三種化療藥物的IC50值下降。轉(zhuǎn)染了miR-4701-5p的小鼠的腫瘤體積在經(jīng)過阿霉素化療后有明顯的改變，并且通過改變miR-47

12、01-5p的表達(dá)可以調(diào)節(jié)ST3GAL1 mRNA和蛋白的表達(dá)。
　　第二部分結(jié)果:
　　(1)ST6GALNAC1、ST6GALNAC2和ST6GALNAC6在KCL22、K562和KU812細(xì)胞中的表達(dá)與其阿霉素耐藥細(xì)胞株的表達(dá)在統(tǒng)計學(xué)上無明顯差異。ST6GALNAC4在三種耐藥細(xì)胞系中呈現(xiàn)高表達(dá)（*P＜0.05）;而ST6GALNAC3和ST6GALNAC5在三對慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞株中無表達(dá)。
　　(2) ST6

13、GALNAC4在CML/MDR患者外周血單個核細(xì)胞中呈高表達(dá)（*P＜0.05）。ST6GALNAC1、ST6GALNAC2和ST6GALNAC6的表達(dá)在兩組中無明顯差異。ST6GALNAC3和ST6GALNAC5在兩組中表達(dá)量較少。
　　(3)干擾ST6GALNAC4后的KCL22/ADR細(xì)胞株在mRNA和蛋白水平上的表達(dá)均顯著降低，作用于KCL22/ADR-ST6GALNAC4 shRNA1細(xì)胞的抗腫瘤藥物的IC50值明顯低于對

14、照組。在經(jīng)阿霉素治療的小鼠和未經(jīng)阿霉素治療的小鼠中，注射KCL22/ADR-ST6GALNAC4 shRNA1的小鼠平均瘤體積均顯著低于shRNA對照組（*P＜0.05）。
　　(4)過表達(dá)ST6GALNAC4，作用于KCL22/ST6GALNAC4細(xì)胞的抗腫瘤藥物的IC50值明顯高于KCL22/mock細(xì)胞的IC50值。在經(jīng)過阿霉素治療的小鼠和未經(jīng)阿霉素治療的小鼠中，注射KCL22/ST6GALNAC4后的平均瘤體積均明顯高于K

15、CL22/mock組。
　　(5)在KCL22、K562和KU812細(xì)胞以及慢性粒細(xì)胞白血病患者外周血單個核細(xì)胞中miR-4299的表達(dá)量明顯上升，而ST6GALNAC4在化學(xué)敏感細(xì)胞株及藥物敏感患者的細(xì)胞中表達(dá)是下降的。在KCL22/ADR細(xì)胞中轉(zhuǎn)染了miR-4299模擬物后，ST6GALNAC4的mRNA及蛋白的表達(dá)量明顯的下降;在轉(zhuǎn)染了miR-4299拮抗劑的KCL22細(xì)胞中，則表現(xiàn)出相反的結(jié)果。而且，轉(zhuǎn)染了wt3'-UTR

16、載體的KCL22/ADR細(xì)胞中miR-4299表達(dá)的熒光素酶活性明顯下降，但是mtST6GALNAC4可以逆轉(zhuǎn)此結(jié)果。
　　(6)MiR-4299的高表達(dá)可上調(diào)KCL22/ADR細(xì)胞對化學(xué)藥物的敏感性，阿霉素、紫杉醇和長春新堿的IC50值下降;同時，在KCL22細(xì)胞中miR-4299被拮抗劑所抑制后，可觀察到這三種化療藥物的IC50值上升。轉(zhuǎn)染了miR-4299的小鼠的腫瘤體積在經(jīng)過阿霉素化療后有明顯的改變，并且改變miR-442

17、99的表達(dá)可以調(diào)節(jié)ST6GALNAC4 mRNA和蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)論:
　　(1)ST3GAL家族和ST6GALNAC家族在三對人慢性粒細(xì)胞白血病親本細(xì)胞株及其三對化學(xué)耐藥細(xì)胞株中存在差異表達(dá)。
　　(2)ST3GAL家族和ST6GALNAC家族在耐藥與非耐藥的慢性粒細(xì)胞白血病患者外周血單個核細(xì)胞中存在差異表達(dá)。
　　(3)改變ST3GAL1和ST6GALNAC4的表達(dá)，可以調(diào)控KCL22和KCL22/ADR