RNA干擾介導(dǎo)Prohibitin基因沉默對人大腸癌細(xì)胞株生物學(xué)特性的影響.pdf

1、目的：利用RNA干擾(RNAi)技術(shù)，特異性沉默Prohibitin(PHB)基因的表達，研究PHB基因?qū)Υ竽c癌細(xì)胞增殖、凋亡和細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)作用，為運用RNAi技術(shù)治療大腸癌的可行性奠定理論和實驗基礎(chǔ)。
　　 方法：以Western blot檢測PHB在多株大腸癌細(xì)胞株中表達，篩選出高表達PHB蛋白細(xì)胞株，以該株細(xì)胞為研究對象，在生長狀態(tài)良好情況下瞬時轉(zhuǎn)染針對靶基因PHB設(shè)計的siRNA三個特異性片段PHB138、PHB173

2、、PHB539，以脂質(zhì)體Lipofectamine2000為載體，轉(zhuǎn)染所篩選出的大腸癌細(xì)胞株，72小時后，通過比較基因沉默后蛋白的表達，篩選出干擾效果最明顯的兩個片段，設(shè)立陰性對照和篩選出的兩個siRNA片段為實驗組，重新轉(zhuǎn)染該株大腸癌細(xì)胞，抑制靶基因PHB表達，通過CCK-8檢測、平板克隆形成實驗、軟瓊脂克隆形成實驗等槍測細(xì)胞增殖能力。在奧沙利鉑藥物誘導(dǎo)基礎(chǔ)上，通過PI和RNase流式檢測細(xì)胞周期；Annexin V-FITC細(xì)咆凋亡

3、試劑流式細(xì)胞術(shù)、Caspase-3/Caspase-9活性檢測等方法檢測細(xì)胞凋亡；Annexin V-FITC試劑和Hoechst染色熒光顯微鏡觀察，記錄細(xì)胞典型凋亡形態(tài)和細(xì)胞核改變。
　　 結(jié)果：Western blot結(jié)果顯示PHB蛋白在七株大腸癌細(xì)胞中均有表達，且在HCT116中表達最高。靶向PHB特異性RNAi化學(xué)合成片段，瞬時轉(zhuǎn)染HCT116后，三個片段均明顯抑制蛋白表達，且片段PHB138、PHB539抑制效果更好。

4、細(xì)胞增殖能力檢測結(jié)果，CCK-8法繪制細(xì)胞生長曲線發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染siRNA沉默PHB基因后可抑制HCT116細(xì)胞的生長；通過平板克隆和軟瓊脂克隆形成實驗檢測PHB對細(xì)胞體外成瘤能力的影響，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染后HCT116細(xì)胞克隆數(shù)量少于陰性對照組，平板克隆形成率分別為NC(43.4士2.11)％、PHB138(31.1±3.05)％、PHB539(12.4±1.26)％；軟瓊脂克隆形成率NC(8.03±0.912)‰、PHB138(4.22±0.569

5、)‰、PHB539(2.82±0.621)‰，且干擾組與NC對照差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。通過細(xì)胞周期分析，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染沉默HCT116細(xì)胞后S期細(xì)胞比例下降，凋亡峰升高，S期比例NC(47.7士8.75)％、PHB138(33.4士0.510)％、PHB539(31.7士1.91)％；應(yīng)用Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡試劑盒流式檢測也同樣發(fā)現(xiàn)D2區(qū)顯示凋亡細(xì)胞比例增加，有統(tǒng)計意義(P＜0.05)；Caspase-3活性度PH

6、B138(1.50士0.392)、PHB539(1.81士0.416)， Caspase-9活性度PHB138(2.02士0.435)、PHB539(2.81士0.517)。Annexin V-FITC和Hoechst染色均在熒光顯微鏡下觀測有明顯的凋亡現(xiàn)象，且凋亡比例和強度比陰性對照強。
　　 結(jié)論：靶向PHB-siRNA干擾可以有效的沉默大腸癌細(xì)胞PHB基因，下調(diào)PHB蛋白水平，從而抑制大腸癌細(xì)胞增殖、促進大腸癌細(xì)胞凋亡；實