ANGPTL4基因表達(dá)對(duì)大腸癌細(xì)胞生物學(xué)特性變化的影響及機(jī)理的研究.pdf

1、大腸癌是常見的惡性腫瘤之一。2010年美國(guó)大腸癌新發(fā)病例數(shù)和死亡病例數(shù)均居美國(guó)惡性腫瘤發(fā)病譜和死亡譜的第3位。盡管在美國(guó)近年來(lái)大腸癌的發(fā)病率以每年3％的速度下降,但在我國(guó),特別是在東部沿海及大城市大腸癌的發(fā)病率仍在不斷上升；靶向藥物的開發(fā)應(yīng)用使得部分晚期大腸癌的生存超過(guò)了2年以上,但總體大腸癌的5年生存率沒有得到顯著的提高。影響大腸癌患者生存的主要因素是腫瘤診斷延遲而出現(xiàn)的腫瘤轉(zhuǎn)移,因此,一方面繼續(xù)加強(qiáng)早期診斷、早期治療,另一方面,深入

2、研究腫瘤浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移的發(fā)生機(jī)理,并且進(jìn)行有效的干預(yù)對(duì)提高腫瘤的5年生存率具有積極的意義。腫瘤轉(zhuǎn)移是一個(gè)復(fù)雜的、多因素調(diào)控的動(dòng)態(tài)過(guò)程,對(duì)于腫瘤轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究將有助于深入了解轉(zhuǎn)移過(guò)程,并可以鑒定到有意義的治療靶標(biāo),為臨床診斷和治療奠定基礎(chǔ)。腫瘤的轉(zhuǎn)移過(guò)程包括:細(xì)胞外基質(zhì)的識(shí)別、細(xì)胞外基質(zhì)的降解、細(xì)胞遷移、脈管內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)播散、靶向性轉(zhuǎn)移器官的選擇等。
　　 人血管生成素樣蛋白4(angiopoietin-like protein4,ANGPT

3、L4)是一種分泌型糖蛋白,其由406個(gè)氨基酸組成,相對(duì)分子質(zhì)量為45.2Kda,N端有卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域,C端有纖維蛋白原樣結(jié)構(gòu)域,含有-糖基化位點(diǎn)。ANGPTL4的表達(dá)受營(yíng)養(yǎng)、激素和缺氧調(diào)控,其中過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferartor-activatedreceptor,PPAR)和缺氧誘導(dǎo)因子-1(hypoxia-inducible factor-1,HIF-1)被認(rèn)為是ANGPTL4的關(guān)鍵調(diào)控基因

4、。ANGPTL4蛋白主要在脂肪組織和胚胎中表達(dá),不同器官來(lái)源的脂肪組織中表達(dá)不同,ANGPTL4在肺、腎、肝臟、垂體、骨骼肌和心臟中也有表達(dá),目前ANGPTL4主要明確的功能是調(diào)節(jié)血管生成、脂肪代謝及糖代謝。ANGPTL4然后也被發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤組織中表達(dá),而且在惡性腫瘤組織中,ANGPTL4主要表達(dá)于壞死灶邊緣。對(duì)ANGPTL4在腫瘤轉(zhuǎn)移中的作用還存在許多爭(zhēng)論,在大腸癌的研究中少見報(bào)道。為了進(jìn)一步研究ANGPTL4在大腸癌進(jìn)展中的作用,

5、我們用半定量RT-PCR法檢測(cè)了ANGPTL4在大腸癌組織標(biāo)本及細(xì)胞株中的表達(dá),并且通過(guò)建立高表達(dá)及基因沉默細(xì)胞株分析ANGPTL4表達(dá)對(duì)大腸癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響,包括細(xì)胞增殖能力MTT分析、軟瓊脂克隆形成能力、Transwell細(xì)胞遷移能力、F-actin免疫熒光染色等；并分析影響產(chǎn)生細(xì)胞行為改變的分子基礎(chǔ)。
　　 結(jié)果:
　　 1)檢測(cè)了41例結(jié)直腸癌患者的腫瘤組織及正常腸粘膜的ANGPTL4mRNA的表達(dá):發(fā)現(xiàn)A

6、NGPTL4mRNA在腫瘤組織中陽(yáng)性表達(dá)17例,陽(yáng)性表達(dá)率41.5％(17／41)；而在配對(duì)的正常腸粘膜中表達(dá)為8例,陽(yáng)性表達(dá)率19.5％(8／41),兩組之間顯著性差異(P≤0.05)；ANGPTL4mRNA的表達(dá)與患者的性別、年齡、腫瘤分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及分期無(wú)明顯相關(guān),但與腫瘤的體積相關(guān),即在ANGPTL4表達(dá)組其平均腫瘤體積明顯大于表達(dá)陰性組(P≤0.05)；
　　 2)檢測(cè)了7個(gè)結(jié)腸癌細(xì)胞株的ANGPTL4mRNA的表達(dá)

7、:ANGPTL4mRNA在DLD1,SW480,HT29中高表達(dá)；HCT116和SW620幾乎不表達(dá)；RKO和COLO320中等表達(dá)；
　　 3)構(gòu)建了穩(wěn)定高表達(dá)ANGPTL4的結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116／ANGPTL4,及ANGPTL4沉默的細(xì)胞株HT29／shRNA-ANGPTL4；
　　 4)HCT116／ANGPTL4的生物學(xué)行為表現(xiàn)為:細(xì)胞軟瓊脂克隆形成能力減弱；MTT分析細(xì)胞增殖無(wú)明顯差異；Transwell實(shí)

8、驗(yàn)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞移動(dòng)能力明顯增加；F-actin免疫熒光發(fā)現(xiàn)細(xì)胞偽足形成增多；
　　 5)HT29／shRNA-ANGPTL4的生物學(xué)行為表現(xiàn)為:細(xì)胞軟瓊脂克隆形成能力增加；MTT分析細(xì)胞增殖無(wú)明顯差異；Transwell實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞移動(dòng)能力明顯減弱；F-actin免疫熒光發(fā)現(xiàn)細(xì)胞偽足形成明顯減少；
　　 6)Western Blot實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)HCT116／ANGPTL4細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)蛋白ERM,pho-ERM,VASP的表達(dá)明顯

9、上調(diào),而細(xì)胞粘附分子E-Cadherin的表達(dá)明顯下降；HT29／shRNA-ANGPTL4則表現(xiàn)為細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)蛋白ERM,pho-ERM,VASP的表達(dá)明顯下降,CD44表達(dá)下降；
　　 7)HCT116／ANGPTL4細(xì)胞的裸鼠體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)能力明顯抑制；
　　 結(jié)論:
　　 ANGPTL4的表達(dá)對(duì)大腸癌細(xì)胞株的體外細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)能力無(wú)明顯影響,但減弱了細(xì)胞的非錨定依賴生長(zhǎng)能力；ANGPTL4的表達(dá)促進(jìn)了細(xì)胞的遷