MIF過表達(dá)對宮頸癌細(xì)胞株SiHa生物學(xué)特性影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、宮頸癌是女性第二大惡性腫瘤，淋巴轉(zhuǎn)移是其獨(dú)立預(yù)后因素，也是宮頸癌患者死亡的主要原因。侵襲和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的主要生物學(xué)特征，尋找影響宮頸癌侵襲轉(zhuǎn)移的相關(guān)分子標(biāo)志物，探索其分子機(jī)制，將有助于宮頸癌轉(zhuǎn)移的早期診斷及治療[1]。
　　 巨噬細(xì)胞移動抑制因子(Macrophage migration inhibitory factor, MIF)是許多炎癥和免疫反應(yīng)的重要調(diào)節(jié)因子，在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[2]。但MIF促進(jìn)腫瘤細(xì)

2、胞浸潤轉(zhuǎn)移的具體作用機(jī)制及其通過何種途徑影響宮頸癌細(xì)胞的生物學(xué)行為尚不完全清楚。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)MIF在宮頸癌細(xì)胞株Caski中高表達(dá)，在SiHa細(xì)胞中低表達(dá)，并發(fā)現(xiàn)MIF在宮頸癌細(xì)胞中通過自分泌調(diào)節(jié)細(xì)胞活性，通過旁分泌促進(jìn)細(xì)胞的增殖分化、浸潤及轉(zhuǎn)移，MIF及其相關(guān)因子可能通過ERK/MAPK、PI3K/Akt等信號傳導(dǎo)通路在早期宮頸癌浸潤轉(zhuǎn)移中起重要作用[3-5]。
　　 基于本課題組的前期研究，本研究利用基因重組技術(shù)，介

3、導(dǎo)目的基因MIF轉(zhuǎn)染至人宮頸癌SiHa細(xì)胞，檢測MIF及其相關(guān)因子IL-8、NF-κB、Bcl-2、CyclinD1的表達(dá)，以及對細(xì)胞增殖、侵襲遷移能力的影響，進(jìn)而探討MIF在宮頸癌浸潤轉(zhuǎn)移中的作用機(jī)制，以期為下一步宮頸癌的基因診斷和治療提供良好的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 目的:研究重組真核表達(dá)載體pEGFP-N1-MIF轉(zhuǎn)染人宮頸癌細(xì)胞SiHa后對MIF及其相關(guān)因子IL-8、NF-κB、Bcl-2、CyclinD1表達(dá)的影響，以及對S

4、iHa細(xì)胞生物學(xué)特性的影響，探討MIF在宮頸癌浸潤轉(zhuǎn)移中的作用機(jī)制。
　　 方法:
　　 1.利用真核表達(dá)載體pEGFP-N1構(gòu)建重組真核表達(dá)載體pEGFP-N1-MIF，應(yīng)用Xho(I)、BamH(I)雙酶切及序列測定鑒定pEGFP-N1-MIF。
　　 2.采用脂質(zhì)體法將重組真核表達(dá)載體pEGFP-N1-MIF轉(zhuǎn)染至低表達(dá)MIF的SiHa細(xì)胞中，熒光顯微鏡下觀察其轉(zhuǎn)染情況。ELISA法檢測各組細(xì)胞（轉(zhuǎn)染重組質(zhì)

5、粒pEGFP-N1-MIF的實(shí)驗(yàn)組、轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pEGFP-N1的陰性對照組、未轉(zhuǎn)染的空白對照組）上清液中MIF蛋白的表達(dá);Real-time PCR及免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測各組細(xì)胞中MIF mRNA及蛋白的表達(dá)水平。
　　 3.Real-time PCR及免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測各組細(xì)胞中IL-8、NF-κB、Bcl-2、CyclinD1 mRNA及蛋白的表達(dá)水平;通過MTT、軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)、Boyden小室趨化實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞劃痕遷移實(shí)驗(yàn)

6、觀察MIF過表達(dá)對SiHa細(xì)胞生物學(xué)特性的影響。
　　 4.應(yīng)用NF-κB抑制劑PDTC干預(yù)SiHa細(xì)胞，免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測MIF、IL-8、NF-κB、Bcl-2、CyclinD1的蛋白表達(dá)情況;MTT、軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)、Boyden小室趨化實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞劃痕遷移實(shí)驗(yàn)檢測PDTC干預(yù)后SiHa細(xì)胞生物學(xué)特性的變化。
　　 結(jié)果:
　　 1.重組真核表達(dá)載體pEGFP-N1-MIF經(jīng)雙酶切后，瓊脂糖凝膠電泳可見約4

7、.7 kb、348 bp處兩條清晰條帶;序列測定結(jié)果與目的序列相同。
　　 2.轉(zhuǎn)染6h后，轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-MIF的實(shí)驗(yàn)組和轉(zhuǎn)染pEGFP-N1的陰性對照組細(xì)胞即可在熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光，且熒光強(qiáng)度隨時(shí)間增加而逐漸增強(qiáng)，48h時(shí)熒光最亮;ELISA證實(shí)實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞上清液中MIF表達(dá)均高于各對照組(P＜0.05);Real-time PCR及免疫細(xì)胞化學(xué)法證實(shí)實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中MIF mRNA和蛋白的表達(dá)水平均高于各對照組(P

8、＜0.05）。
　　 3.Real-time PCR及免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)染48h后，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中IL-8、NF-κB、Bcl-2、CyclinD1 mRNA和蛋白的表達(dá)均明顯增高，與陰性對照組、空白對照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）;且MIF與IL-8、NF-κB、Bcl-2、CyclinD1 mRNA和蛋白之間存在正相關(guān)(P＜0.05)，NF-κB與IL-8、Bcl-2、CyclinD1 mRNA和蛋白之

9、間存在正相關(guān)（P＜0.05），IL-8與Bcl-2、CyclinD1mRNA和蛋白之間也存在正相關(guān)（P＜0.05）。
　　 MTT法檢測結(jié)果顯示:實(shí)驗(yàn)組與陰性對照組、空白對照組相比，轉(zhuǎn)染后SiHa細(xì)胞的增殖作用明顯增強(qiáng)(P＜0.05），且隨轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)時(shí)間延長，促增殖作用更加明顯;而陰性對照組與空白對照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。
　　 軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:實(shí)驗(yàn)組與各對照組相比，克隆形成數(shù)明顯增多(P

10、＜0.05)，而陰性對照組與空白對照組間無顯著差異（P＞0.05）。
　　 Boyden小室趨化實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:實(shí)驗(yàn)組、陰性對照組、空白對照組細(xì)胞在每個(gè)視野的平均穿膜細(xì)胞數(shù)分別為(268.930±7.923)個(gè)、(108.070±5.271)個(gè)、(111.930±4.464)個(gè)。實(shí)驗(yàn)組與各對照組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);而陰性對照組與空白對照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。
　　 劃痕遷移實(shí)驗(yàn)顯示

11、實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞遷移率明顯高于各對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而陰性對照組與空白對照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。
　　 4.NF-κB抑制劑PDTC干預(yù)SiHa細(xì)胞后，MIF、IL-8、NF-κB、Bcl-2、CyclinD1的蛋白表達(dá)受到明顯抑制;且MIF與IL-8、NF-κB、Bcl-2、CyclinD1蛋白表達(dá)存在正相關(guān)(P＜0.05)，NF-κB與IL-8、Bcl-2、CyclinD1蛋白表達(dá)存在正相

12、關(guān)(P＜0.05)，IL-8與Bcl-2、CyclinD1蛋白表達(dá)也存在正相關(guān)(P＜0.05)。
　　 MTT法結(jié)果顯示:運(yùn)用PDTC在不同濃度、不同時(shí)間干預(yù)下，其對SiHa細(xì)胞的抑制率呈時(shí)間-劑量關(guān)系，100μmol/L PDTC明顯抑制SiHa細(xì)胞的增殖活性，且在72 h時(shí)其抑制作用最為明顯。
　　 軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞培養(yǎng)3天后，在相差顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞有小集落形成，而加PDTC抑制劑組未發(fā)現(xiàn)集落形

13、成。隨培養(yǎng)時(shí)間延長實(shí)驗(yàn)組集落逐漸增多增大，且分布于不同層面;而加PDTC抑制劑組集落明顯變小，并且隨著PDTC濃度的增加，集落形成數(shù)逐漸減少。
　　 Boyden小室趨化實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:隨著PDTC濃度的增高，穿膜細(xì)胞數(shù)減少。
　　 細(xì)胞劃痕遷移實(shí)驗(yàn)顯示:細(xì)胞遷移率隨抑制劑PDTC濃度的增加逐漸變小。100μmol/LPDTC干預(yù)pEGFP-N1-MIF-SiHa細(xì)胞后，劃痕寬度無明顯變化。
　　 結(jié)論:
　

14、　 1.重組真核表達(dá)載體pEGFP-N1-MIF構(gòu)建成功。
　　 2.轉(zhuǎn)染重組真核表達(dá)載體pEGFP-N1-MIF后SiHa細(xì)胞中MIF過表達(dá)。
　　 3.MIF過表達(dá)可上調(diào)IL-8、NF-κB、Bcl-2、CyclinD1的表達(dá)，并增強(qiáng)SiHa細(xì)胞體外增殖、侵襲遷移能力。
　　 4.PDTC明顯抑制MIF、IL-8、NF-κB、Bcl-2、CyclinD1的表達(dá)，并抑制SiHa細(xì)胞體外增殖、侵襲遷移能力。

15、r>　　 5.MIF與IL-8、NF-κB、Bcl-2、CyclinD1之間，NF-κB與IL-8、Bcl-2、CyclinD1之間，IL-8與Bcl-2、CyclinD1之間均存在正相關(guān)，推測MIF可能通過NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)節(jié)IL-8、Bcl-2、CyclinD1等下游因子的基因表達(dá)，而IL-8又可與相應(yīng)受體結(jié)合，激活NF-κB通路促進(jìn)Bcl-2、CyclinD1等下游因子的基因表達(dá)，從而促進(jìn)宮頸癌的侵襲和轉(zhuǎn)移。