RNA干擾沉默HIF-1α表達(dá)對改造急性白血病骨髓造血微環(huán)境作用的探索.pdf

1、背景與目的 骨髓造血微環(huán)境的異常是白血病形成和發(fā)展過程中的重要環(huán)節(jié)之一，在白血病骨髓造血微環(huán)境的形成過程中，既包含有骨髓異常缺氧微環(huán)境和骨髓血管新生的形成過程，也有骨髓微環(huán)境內(nèi)各種粘附和趨化因子(包括VEGF、SDF-1等)的分泌異常。缺氧誘導(dǎo)因子-1α(Hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)作為一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，其在腫瘤及腫瘤基質(zhì)的形成過程中發(fā)揮著重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用，已有研究表明HIF-1α參

2、與了血管內(nèi)皮生長因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)、基質(zhì)衍生因子-1(Stromalderived factor-1，SDF-1)的表達(dá)調(diào)控，同時(shí)，它還直接或者間接地參與了血管新生、基質(zhì)缺氧微環(huán)境的發(fā)生以及細(xì)胞增殖與凋亡的調(diào)節(jié)過程。HIF-1α可能是白血病骨髓造血微環(huán)境形成過程中的重要調(diào)控因子。本研究擬構(gòu)建針對HIF-1α的miRNA干擾質(zhì)粒載體，以研究沉默白血病骨髓基質(zhì)細(xì)胞(Bone

3、 marrow stromal cells，BMSCs)HIF-1α表達(dá)后，對BMSCs以及與之共培養(yǎng)的白血病細(xì)胞功能的影響，探討HIF-1α在白血病骨髓造血微環(huán)境形成過程中的調(diào)控機(jī)制，為探索從新的角度治療白血病提供理論依據(jù)。 研究方法 1、分離培養(yǎng)急性白血病和正常對照骨髓基質(zhì)細(xì)胞，RT-PCR法檢測骨髓基質(zhì)細(xì)胞HIF-1α mRNA的表達(dá)，免疫組織化學(xué)法檢測骨髓基質(zhì)細(xì)胞P53、PTEN、HIF-1α表達(dá)和分布，ELIS

4、A法檢測骨髓基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)上清SDF-1、VEGF的表達(dá)： 2、設(shè)計(jì)合成針對HIF-1α的3組pre-miR RNA干擾序列，構(gòu)建帶有報(bào)告基因EmGFP的pcDNA<'TM>6.2-GW/EmGFP-HIF-1α miR干擾質(zhì)粒，測序鑒定構(gòu)建成功后，應(yīng)用脂質(zhì)體Lipofectamine 2000介導(dǎo)pcDNA<'TM>6.2-GW/EmGFP-HIF-1α miR干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染急性白血病骨髓基質(zhì)細(xì)胞，抗稻菌素篩選陽性克隆擴(kuò)增，RT-

5、PCR檢測干擾后HIF-1α mRNA表達(dá)，從備選的3組pre-miR RNA干擾序列挑選一組有效序列進(jìn)行慢病毒載體構(gòu)建； 3、構(gòu)建針對HIF-1α的慢病毒miR RNA干擾質(zhì)粒載體pLenti6/V5-GW/EmGFP-HIF-1α-miR，應(yīng)用脂質(zhì)體Lipofectamine 2000介導(dǎo)聯(lián)合ViraPower<'TM>混和慢病毒包裝質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞產(chǎn)毒，產(chǎn)毒上清感染PT67細(xì)胞進(jìn)行滴度測定。病毒感染急性白血病骨髓基質(zhì)

6、細(xì)胞，抗稻菌素篩選后，Realtime-PCR檢測干擾后HIF-1α mRNA表達(dá)，western-blot檢測干擾后HIF-1α蛋白表達(dá)。 4、實(shí)驗(yàn)分組為①急性白血病基質(zhì)細(xì)胞miR RNAi感染組(簡稱miR RNAi感染組)；②急性白血病基質(zhì)細(xì)胞miR-neg感染組(簡稱miR-neg感染組)③急性白血病基質(zhì)細(xì)胞未感染組(簡稱未處理組)。ELISA法檢測各組骨髓基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)上清VEGF、SDF-1、VCAM-1表達(dá)，MTT

7、檢測各組白血病骨髓基質(zhì)細(xì)胞增殖。Jurkat細(xì)胞與各組骨髓基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)，細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測Jurkat細(xì)胞粘附、增殖的變化，流式細(xì)胞儀法檢測Jurkat細(xì)胞細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期變化，Transwell法檢測Jurkat細(xì)胞遷移侵襲功能變化。 結(jié)果： 1、急性白血病骨髓基質(zhì)細(xì)胞HIF-1α mRNA表達(dá)量顯著高于對照組(P<0.01)；急性白血病骨髓基質(zhì)細(xì)胞HIF-1α、P53表達(dá)的陽性率顯著高于對照組(P<0.01)，急性白

8、血病骨髓基質(zhì)細(xì)胞PTEN表達(dá)陽性率顯著低于對照組(P<0.01)，HIF-1α與P53表達(dá)存在正性關(guān)聯(lián)，與PTEN表達(dá)存在負(fù)性關(guān)聯(lián)；急性白血病骨髓基質(zhì)細(xì)胞SDF-1、VEGF表達(dá)顯著高于對照組(P<0.01)，且兩種因子的高表達(dá)趨勢與HIF-1α表達(dá)陽性率具有一致性。 2、構(gòu)建成功帶有報(bào)告基因EmGFP的pcDNA<'TM>6.2-GW/EmGFP-HIF-1α miR干擾質(zhì)粒，并能成功轉(zhuǎn)染急性白血病骨髓基質(zhì)細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后基質(zhì)細(xì)胞

9、HIF-1α mRNA表達(dá)顯著低于未轉(zhuǎn)染細(xì)胞(P<0.01)，提示通過miR RNA干擾法可以有效沉默基質(zhì)細(xì)胞HIF-1α表達(dá)。 3、構(gòu)建成功針對HIF-1α的慢病毒miR RNA干擾質(zhì)粒載體pLenti6/V5-GW/EmGFP-HIF-1α-miR，293FT細(xì)胞產(chǎn)毒后可以穩(wěn)定感染急性白血病骨髓基質(zhì)細(xì)胞。Realtime-PCR檢測轉(zhuǎn)染后急性白血病骨髓基質(zhì)細(xì)胞HIF-1α mRNA顯著低于未感染細(xì)胞(P<0.01)，West

10、ern-blot檢測感染后急性白血病骨髓基質(zhì)細(xì)胞HIF-1α蛋白表達(dá)顯著低于未轉(zhuǎn)染細(xì)胞(P<0.01)，提示以慢病毒為載體的miR RNA干擾法可以有效沉默基質(zhì)細(xì)胞HIF-1α表達(dá)。 4、沉默HIF-1α后急性白血病骨髓基質(zhì)細(xì)胞SDF-1、VEGF表達(dá)分別為3127.25±615.42pg/ml和198.32±54.69pg/ml，顯著低于未處理組SDF-1、VEGF表達(dá)(4785.23±568.24pg/ml，312.55±4

11、5.68pg/ml)(P<0.01)；沉默HIF-1α表達(dá)后急性白血病骨髓基質(zhì)細(xì)胞貼壁增殖與未處理組無顯著差異(P>0.05)。 5、骨髓基質(zhì)細(xì)胞與Jurkat細(xì)胞共培養(yǎng)3天，Jurkat細(xì)胞增殖顯示：miR RNAi感染組倍增時(shí)間為50小時(shí)，低于未處理組(34小時(shí))；急性白血病骨髓基質(zhì)細(xì)胞與Jurkac細(xì)胞共培養(yǎng)24小時(shí)，miR RNAi感染組Jurkat細(xì)胞粘附率為(28.35±5.91)％，顯著低于未處理組(47.58±6

12、.63)％(P<0.01)；骨髓基質(zhì)細(xì)胞與Jurkat細(xì)胞共培養(yǎng)72小時(shí)，miR RNAi感染組Jurkat細(xì)胞較未處理組G2/M期細(xì)胞增多(P<0.01)，S期細(xì)胞比例減少(P<0.01)；骨髓基質(zhì)細(xì)胞與Jurkat細(xì)胞共培養(yǎng)72小時(shí)，miR RNAi感染組Jurkat細(xì)胞凋亡率為(17.78±4.87)％，顯著高于未處理組的(6.53±3.28)％(P<0.01)；骨髓基質(zhì)細(xì)胞與Jurkat細(xì)胞Trnaswell培養(yǎng)，miR RNA

13、i感染組Jurkat細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)為25±8 cells，顯著低于未處理組(48±9)(P<0.01)。提示沉默急性白血病骨髓基質(zhì)細(xì)胞HIF-1α表達(dá)后，能抑制共培養(yǎng)的Jurkat細(xì)胞增殖、粘附和遷移侵襲能力，促進(jìn)其凋亡。 結(jié)論： 急性白血病骨髓基質(zhì)細(xì)胞存在HIF-1α高表達(dá)；構(gòu)建的針對HIF-1α的miR RNAi慢病毒載體可以有效地沉默急性白血病骨髓基質(zhì)細(xì)胞HIF-1α表達(dá)；通過沉默急性白血病骨髓基質(zhì)細(xì)胞HIF-1α