RNA干擾沉默HIF-1α對(duì)人乳腺癌細(xì)胞功能的影響.pdf

1、研究背景缺氧誘導(dǎo)因子-1(hypoxia-induciblefactor-1，HIF-1)是缺氧條件下產(chǎn)生的一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，其誘導(dǎo)表達(dá)的基因與能量代謝、細(xì)胞周期阻滯、細(xì)胞生存與增殖、血管新生、血管舒縮、紅細(xì)胞生成、腫瘤生長，轉(zhuǎn)移以及腫瘤多藥耐藥等相關(guān)。多數(shù)腫瘤具有缺氧的微環(huán)境，在腫瘤形成過程中一個(gè)關(guān)鍵的步驟是對(duì)缺氧的適應(yīng)，HIF-1就在這個(gè)過程中發(fā)揮了重要的作用。HIF-1廣泛存在于動(dòng)物及人體的多種腫瘤細(xì)胞中，其活性對(duì)維持腫瘤細(xì)胞的

2、能量代謝，血管新生，促進(jìn)腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移起到重要作用，因此成為腫瘤治療的重要靶點(diǎn)。新近發(fā)展起來的RNA干擾技術(shù)能夠高效特異地沉默靶基因的表達(dá)，成為基因治療的重要工具。目的研究靶向針對(duì)缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)的短發(fā)夾RNA(shRNA)對(duì)人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7細(xì)胞功能的影響。方法通過在細(xì)胞培養(yǎng)中加入150μmol/L氯化鈷(CoCl2)模擬低氧環(huán)境。采用RNA干擾技術(shù)，構(gòu)建靶向針對(duì)HIF-1α的shRNA真核表達(dá)載體，利用脂質(zhì)體

3、lipofactamine2000將shRNA真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染入MCF-7細(xì)胞中，經(jīng)G418(400μg/ml)篩選得到抗性克隆。MCF-7細(xì)胞經(jīng)150μmol/L的CoCl2處理24小時(shí)后，通過Real-timePCR和Westernblot分別檢測HIF-1α的mRNA和蛋白水平的變化。AnnexinV/PI熒光標(biāo)記檢測細(xì)胞經(jīng)150μmol/L的CoCl2處理24小時(shí)后MCF-7細(xì)胞凋亡的變化。同樣通過Real-timePCR和We

4、sternblot分別檢測轉(zhuǎn)染shRNA后MCF-7細(xì)胞中HIF-1αmRNA水平和蛋白水平的變化。30μg/mlAra-c作為凋亡誘導(dǎo)劑，AnnexinV/PI熒光標(biāo)記和DNAladder分別檢測Ara-c作用48小時(shí)后，同時(shí)加入150μmol/L的CoCl2，干擾組、對(duì)照組和未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞凋亡的區(qū)別。用Sub-G1測定未加任何凋亡誘導(dǎo)劑，只加入150μmol/L的CoCl2后，干擾組、對(duì)照組和未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞凋亡的區(qū)別。RT-PCR檢測R

5、NA干擾HIF-1α后，MCF-7中血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)表達(dá)的變化。流式細(xì)胞儀檢測RNA干擾HIF-1α后，MCF-7細(xì)胞周期的變化。結(jié)果缺氧后，MCF-7細(xì)胞中的HIF-1α表達(dá)增加，而凋亡率較常氧降低。shRNA轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞后，HIF-1α的表達(dá)下調(diào)91.63％(p＜0.01)。阿糖胞苷(Ara-c)誘導(dǎo)或無凋亡誘導(dǎo)劑時(shí)，干擾組凋亡率比未轉(zhuǎn)染組分別增高62.15％(p＜0.01)和98.42％(p＜0.01)。與未轉(zhuǎn)染