RNA沉默HIF-1α對NB4急性早幼粒細(xì)胞生物學(xué)行為的影響.pdf

1、目的:
　　研究低氧狀態(tài)HIF-1α基因干擾對NB4急性早幼粒細(xì)胞的增殖、侵潤和分化等生物學(xué)行為影響，探索HIF-1α對急性早幼粒白血病細(xì)胞分化的相關(guān)機制。
　　方法:
　　設(shè)計及合成HIF-1α特異性siRNA，構(gòu)建HIF-1α siRNA重組慢病毒和陰性對照組慢病毒，通過感染篩選出最佳慢病毒載體。CoCl2模擬缺氧微環(huán)境，檢測不同濃度梯度對NB4細(xì)胞增殖的影響，選擇最利于NB4細(xì)胞生長的CoCl2濃度，作為模擬缺氧

2、微環(huán)境的終濃度。利用最佳慢病毒載體干擾NB4細(xì)胞中HIF-1α的表達(dá)，RT-PCR檢測HIF-1α的mRNA表達(dá)水平和Western blot檢測細(xì)胞內(nèi)HIF-1α蛋白、VEGF蛋白、SDF-1蛋白的干擾效果，用新型四唑單鈉鹽試劑盒(CCK-8)檢測實驗組和對照組的細(xì)胞存活率，用AnnexinⅤ-PE細(xì)胞凋亡檢測試劑盒檢測HIF-1α干擾下實驗組和對照組細(xì)胞凋亡水平變化，使用流式細(xì)胞術(shù)檢測實驗組和對照組細(xì)胞CD11b的表達(dá)以分析NB4的

3、成熟分化程度，探索HIF-1α對急性早幼粒白血病細(xì)胞分化的相關(guān)機制。
　　結(jié)果:
　　1、模擬缺氧微環(huán)境， CoCl2終濃度在100μmol/L時，細(xì)胞增殖效率、HIF-1αRNA表達(dá)水平顯著性高于常氧條件培養(yǎng)NB4細(xì)胞（P＜0.05），對NB4細(xì)胞影響作用最強。
　　2、MOI為25、50、75時，GFP表達(dá)率均值為50.6％、75.3％、98.2％，三組MOI存在顯著性差異(P＜0.01)，因此選擇MOI為75是較

4、合理的選擇。
　　3、流式細(xì)胞術(shù)檢測感染細(xì)胞上GFP表達(dá)強度，評估慢病毒干擾細(xì)胞株NB4轉(zhuǎn)染效率，與陰性慢病毒比較，慢病毒4對于NB4細(xì)胞的熒光感染效率最低(P＜0.01)，慢病毒1、慢病毒2、慢病毒3感染效率很高且彼此間無顯著性差異(P＜0.05);RT-PCR檢測各組感染細(xì)胞中HIF-1αRNA表達(dá)情況，與陰性對照相比，慢病毒2感染NB4細(xì)胞HIF-1α表達(dá)率最低（P＜0.01），慢病毒2載體干擾NB4細(xì)胞可作為實驗組。

5、>　　4、與陰性對照組相比，實驗組細(xì)胞增殖率、HIF-1αmRNA抑制率均下降，有顯著性差異(P＜0.01); HIF-1α蛋白、VEGF蛋白和SDF-1蛋白表達(dá)下降(P＜0.05);實驗組細(xì)胞凋亡率、細(xì)胞侵襲、細(xì)胞分化、遷移有顯著性差異（P＜0.01）。細(xì)胞形態(tài)學(xué)顯示，實驗組細(xì)胞的凋亡和死亡的細(xì)胞數(shù)量增加明顯(P＜0.01)。
　　結(jié)論:
　　通過研究發(fā)現(xiàn)HIF-1α基因調(diào)節(jié)HIF-1α蛋白、VEGF蛋白和SDF-1蛋白來

6、實現(xiàn)細(xì)胞生物活性，對NB4的增殖起重要作用;RNA沉默HIF-1α基因，在缺氧狀態(tài)，HIF-1α RNA基因表達(dá)下降，HIF-1α蛋白、VEGF蛋白和SDF-1蛋白均下調(diào)，實驗細(xì)胞的增殖能力受到明顯抑制，細(xì)胞凋亡率大大增加，成熟分化比例顯著增加。同時發(fā)現(xiàn)利用CD11b可作為評估早幼粒白血病細(xì)胞向成熟分化的檢測指標(biāo)。本研究利用基因干擾技術(shù)，下調(diào)缺氧誘導(dǎo)信號通路中目的基因和相關(guān)蛋白質(zhì)的表達(dá)，為治療急性早幼粒白血病拓展一種新的基因靶點，從基因