KIM-1在白蛋白所致腎小管上皮細(xì)胞損傷中的作用機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　慢性腎功能衰竭嚴(yán)重危害人類健康，如何延緩腎臟病進(jìn)展是臨床醫(yī)生面臨的重要問(wèn)題。在腎臟病進(jìn)展過(guò)程中，蛋白尿所致腎小管損傷是非常重要的病理因素。腎損傷分子-1(kidney injury molecule-1，KIM-1)是新近發(fā)現(xiàn)的在腎小管上皮細(xì)胞表達(dá)的蛋白。目前研究證明KIM-1不僅僅是急性腎損傷的生物標(biāo)志物，也參與慢性腎損傷。既往研究提示蛋白負(fù)荷腎病腎小管上皮細(xì)胞KIM-1表達(dá)增加，且與腎小管損傷密切相關(guān)，但機(jī)制尚不明

2、確。本研究利用體外培養(yǎng)的人近曲腎小管上皮細(xì)胞（HK-2）觀察在白蛋白所致腎小管損傷過(guò)程中KIM-1的表達(dá)情況，闡明在白蛋白所致HK-2細(xì)胞凋亡和上皮細(xì)胞-間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化(epithelial-mesenchymaltransformation，EMT)過(guò)程中KIM-1的可能病理作用及機(jī)制。
　　方法：
　　1、培養(yǎng)HK-2細(xì)胞，分別用不同濃度(5mg/ml、15mg/ml、20mg/ml)的人血白蛋白處理細(xì)胞不同時(shí)間(6h

3、、24h)，利用Western blotting檢測(cè)KIM-1的表達(dá)。
　　2、體外培養(yǎng)HK-2細(xì)胞，將細(xì)胞分為四組（A組:對(duì)照組; B組:HSA組;C組:空載-HSA組; D組:shRNA-HSA組）。制備KIM-1的shRNA質(zhì)粒，用脂質(zhì)體lipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染HK-2細(xì)胞敲除KIM-1，給予白蛋白(20mg/ml)處理6h。通過(guò)Western blotting方法觀察KIM-1蛋白表達(dá)情況。通過(guò)流式細(xì)胞技

4、術(shù)以及Western blotting方法檢測(cè)bcl-2和Bax的表達(dá)評(píng)估HK-2細(xì)胞的凋亡情況。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)活細(xì)胞內(nèi)ROS含量，比色法檢測(cè)超氧化物歧化酶活性和丙二醛含量評(píng)估HK-2細(xì)胞的氧化應(yīng)激程度。探討KMI-1在白蛋白所致HK-2細(xì)胞凋亡及氧化應(yīng)激損傷中的可能作用。
　　3、體外培養(yǎng)HK-2細(xì)胞，將細(xì)胞分為四組（A組:對(duì)照組; B組:HSA組;C組:空載-HSA組; D組:KIM-1-HSA組）。制備KIM-1的過(guò)表達(dá)

5、載體，用脂質(zhì)體lipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染HK-2細(xì)胞使其過(guò)表達(dá)KIM-1，給予白蛋白(5mg/ml)處理24h。通過(guò)Westem blotting方法觀察KIM-1蛋白表達(dá)情況。通過(guò)光鏡檢測(cè)細(xì)胞形態(tài)變化，利用Western blotting方法檢測(cè)E-鈣黏素(E-cadherin)、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)的表達(dá)評(píng)估HK-2細(xì)胞EMT程度。通過(guò)Western blotting方法檢測(cè)p38MAPK磷酸化的程度。探

6、討KIM-1在HK-2細(xì)胞EMT過(guò)程中的可能作用機(jī)制。
　　結(jié)果：
　　1、在白蛋白作用下HK-2細(xì)胞KIM-1表達(dá)明顯增強(qiáng)，不同濃度白蛋白和不同處理時(shí)間KIM-1表達(dá)程度相同。
　　2、白蛋白作用于HK-2細(xì)胞后KIM-1表達(dá)明顯增加，細(xì)胞凋亡明顯增加，Bax表達(dá)增加，bcl-2表達(dá)下降，同時(shí)氧化應(yīng)激反應(yīng)也增強(qiáng)。給予KIM-1敲除后能夠明顯減輕HK-2細(xì)胞凋亡，減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)。
　　3、白蛋白作用于HK-2細(xì)

7、胞，光鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)發(fā)生明顯改變。Westernblotting檢測(cè)顯示白蛋白導(dǎo)致HK-2細(xì)胞α-SMA表達(dá)增強(qiáng)，E-cadherin表達(dá)減弱，提示HK-2細(xì)胞發(fā)生EMT。而KIM-1過(guò)表達(dá)使上述改變更加明顯。另外發(fā)現(xiàn)在白蛋白導(dǎo)致HK-2細(xì)胞EMT過(guò)程中p38MAPK磷酸化明顯，而KIM-1的過(guò)表達(dá)能夠進(jìn)一步促進(jìn)p38MAPK的磷酸化。
　　結(jié)論：
　　1、白蛋白導(dǎo)致HK-2細(xì)胞KIM-1表達(dá)明顯增加。
　　2、K