動力相關蛋白-1在缺氧復氧誘導人腎小管上皮細胞焦亡機制中的作用.pdf

1、急性腎損傷（acute kidney injury，AKI）發(fā)病率高、死亡率也高，對一些重癥AKI尚缺乏有效的治療方法[1]。線粒體是細胞代謝的主要能量來源，也是調節(jié)細胞死亡的重要細胞器。細胞損傷或缺氧時，可通過激活Caspase系統(tǒng)或ROS的釋放，啟動不同類型的細胞死亡[2]。致病因素導致腎小管上皮細胞線粒體功能障礙，進而激活多種細胞死亡通路，可能是AKI發(fā)生發(fā)展的重要機制。新近研究表明，焦亡是AKI時腎小管上皮細胞死亡的主要方式，但

2、目前對其發(fā)生機制及信號通路知之甚少。我們前期研究發(fā)現(xiàn)Nod樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3(ACHT，LRR and PYD domains-containingprotein3，Nlrp3)在AKI發(fā)病機制中發(fā)揮著重要作用，并在腎小管上皮細胞焦亡發(fā)生中扮演關鍵角色，但其上游調控通路及其機制尚不清楚。目前研究顯示線粒體功能障礙在Nlrp3激活中起到了中樞作用，而動力相關蛋白-1(dynamin-related protein1，Drp1)是

3、線粒體分裂的關鍵“分子開關”，參與了線粒體功能障礙的發(fā)生發(fā)展[3]。最新研究顯示RNA病毒可通過Drp1介導Nlrp3的激活[4]。但是Drp1、線粒體功能障礙和Nlrp3三者之間的相互關系及調控機制尚不明了?；谏鲜霰尘?，我們提出Drp1通過調控線粒體/Nlrp3軸進而介導AKI中腎小管上皮細胞焦亡的假設。本項目首先驗證急性腎損傷中腎上皮細胞的焦亡效應，再通過分別干預Drp1，線粒體/Nlrp3軸，以研究Drp1、線粒體及炎癥體分子之

4、間的相互作用及調控機制，為闡釋AKI中腎小管上皮細胞焦亡的發(fā)生機制，尋找AKI治療的新靶點提供新思路。
　　內容：
　　本研究擬采用缺氧復氧(H/R)措施處理人腎小管上皮細胞（HK-2細胞），以模擬HK-2細胞缺血再灌注損傷，并檢測被處理細胞的炎性因子IL-1β以及caspase-1蛋白表達水平及腎小管上皮細胞焦亡情況，探討缺血再灌注(I/R)后人腎小管上皮細胞炎癥及焦亡反應狀態(tài)，并檢測HK-2細胞中Nlrp3炎性體、活性氧

5、ROS、Drp1的表達，探討I/R導致HK-2細胞炎性因子IL-1β活化及焦亡的可能機制。同時使用Mdivi-1阻斷Drp1的活性，再檢測H/R的HK-2細胞中Drp1、Nlrp3炎性體表達變化，同時對H/R的HK-2細胞炎性因子IL-1β表達水平、活性氧ROS、腎小管上皮細胞焦亡及焦亡相關分子表達進行檢測，研究Drp1在炎癥及焦亡反應中的作用及其可能機制。
　　方法：
　　1.體外擴增siNlrp3腺病毒，計算病毒滴度和M

6、OI值，供后續(xù)試驗。
　　2.體外培養(yǎng)人腎小管上皮細胞，用缺氧復氧條件模擬人腎小管上皮細胞缺血再灌注模型。
　　3.用流式細胞儀觀察各組細胞焦亡的情況。
　　4.采用Beckman AU5800全自動生化分析儀對各組細胞上清中乳酸脫氫酶的水平進行檢測。
　　5.激光共聚焦觀察各組細胞活性氧的表達水平。
　　6.采用Western blot法對Nlrp3、caspase-1、Drp1、IL-1β蛋白在各組細胞

7、中的表達進行檢測。
　　結果：
　　1.缺氧復氧誘導人腎小管上皮細胞發(fā)生了細胞焦亡。
　　(1)正常對照組:細胞培養(yǎng)上清液中乳酸脫氫酶LDH為36.90±1.89 IU/L，流式細胞儀檢測顯示，正常對照組細胞焦亡率僅為0.115％。
　　(2)缺氧/復氧(H/R)組:缺氧復氧24h后，細胞上清液中焦亡相關分子乳酸脫氫酶顯著升高達58.80±6.58 IU/L，與正常對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05）;人

8、腎小管上皮細胞焦亡率增多至5.27％，與正常對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05），說明缺氧復氧能顯著增加人腎小管上皮細胞的焦亡。
　　2.缺氧復氧誘導人腎小管上皮細胞Nlrp3炎性體、IL-1β、caspase-1水平升高，沉默Nlrp3能減少Nlrp3炎性體、IL-1β、caspase-1表達水平，同時降低人腎小管上皮細胞焦亡率。
　　(1)正常對照組:人腎小管上皮細胞中Nlrp3、caspase1、炎性因子IL-

9、1β水平較低。
　　(2)缺氧/復氧(H/R)組:與正常對照組相比，缺氧復氧24h后，人腎小管上皮細胞Nlrp3、caspase-1活化增加，炎性因子IL-1β水平顯著升高(P＜0.05）。
　　(3)缺氧/復氧+Nlrp3沉默腺病毒(H/R+siNlrp3)組:與缺氧/復氧(H/R)組相比，缺氧復氧24h后，人腎小管上皮細胞焦亡升高程度(1.78％)顯著低于缺氧/復氧組(5.27％)(P＜0.05)，人腎小管上皮細胞Nlr

10、p3、caspase-1活化減少，炎性因子IL-1β水平顯著降低(P＜0.05），表明siNlrp3腺病毒能有效地減輕缺氧復氧誘導的人腎小管上皮細胞焦亡，Nlrp3參與了缺氧復氧導致的人腎小管上皮細胞焦亡。
　　3.缺氧復氧誘導人腎小管上皮細胞中Drp1、ROS表達上調，Mdivi-1能抑制Drp1活化，減少ROS表達，同時降低Nlrp3、caspase1、炎性因子IL-1β水平，并減少細胞焦亡。
　　(1)正常對照組:人腎

11、小管上皮細胞中Drp1、ROS水平較低。
　　(2)缺氧/復氧(H/R)組:與正常組相比，缺氧復氧24h后，人腎小管上皮細胞Drp1表達顯著上調(P＜0.05），細胞中活性氧表達也顯著升高。
　　(3)缺氧/復氧+Mdivi-1(H/R+Mdivi-1)組:缺氧/復氧(H/R)組，Mdivi-1未能明顯降低Drp1表達，但細胞中活性氧的表達顯著降低，人腎小管上皮細胞焦亡升高程度(1.8％)顯著低于缺氧/復氧組(5.27％)(

12、P＜0.05），人腎小管上皮細胞Nlrp3、caspase-1活化減少，炎性因子IL-1β水平顯著降低（P＜0.05），提示抑制Drp1活化能有效減低細胞活性氧水平，降低人腎小管上皮細胞Nlrp3、caspase-1表達，Drp1參與了缺氧復氧誘導的人腎小管上皮細胞焦亡。
　　結論：
　　1.細胞焦亡是缺氧/復氧誘導腎小管上皮細胞死亡的重要方式。
　　2.缺氧/復氧通過上調Drp1，誘導Nlrp3炎性體表達和線粒體功能