NALP3-siRNA對缺氧-復氧誘導大鼠腎小管上皮細胞凋亡的保護作用及其機制.pdf

1、目的：觀察缺氧/復氧對大鼠近端腎小管上皮細胞(NRK-52E)的損傷以及對胞內(nèi)模式識別受體NALP3蛋白表達的影響。并通過構建NALP3-siRNA抑制大鼠腎小管上皮細胞NALP3的表達，探討其對缺氧/復氧誘導細胞凋亡的保護作用及其機制。
　　 方法：(1)利用三氣培養(yǎng)箱調(diào)整氮氣壓力條件形成缺氧條件，缺氧1h，分別復氧1h、2h、4h、8h、16、24h后收集細胞和培養(yǎng)上清液。胎盤藍攝取法進行活細胞計數(shù)，并檢測培養(yǎng)上清液中的乳酸

2、脫氫酶(LDH)含量以及細胞NALP3蛋白的表達。(2)根據(jù)大鼠NALP3全長基因序列設計并合成NALP3-si-RNA質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染大鼠腎小管上皮細胞(NRK-52E)，以無關siRNA轉(zhuǎn)染組作為對照。用Western印跡法檢測轉(zhuǎn)染細胞NALP3蛋白的表達。(3)將細胞分為正常對照組、H/R組、無關siRNA轉(zhuǎn)染組和NALP3-siRNA轉(zhuǎn)染組。利用三氣培養(yǎng)箱調(diào)整氮氣壓力形成缺氧條件，缺氧1h復氧4h后檢測培養(yǎng)液上清LDH的含量和細胞NA

3、LP3蛋白的表達。(4)采用AnnexinV/IP染色結合流式細胞儀檢測細胞凋亡率；Western印跡法檢測細胞IκB-α、Bax和Bcl-2蛋白的表達；EMSA檢測NF-κBDNA結合活性。
　　 結果：(1)與對照組相比，NRK-52E缺氧/復氧后LDH升高(p＜0.05)，活細胞計數(shù)和細胞存活率較對照組顯著下降(p＜0.05)，細胞NALP3表達逐漸增加，在復氧4h達到高峰。(2)特異性NALP3-siRNA能有效抑制NR

4、K-52E的NALP3表達，與無關siRNA轉(zhuǎn)染組相比，NALP3-siRNA轉(zhuǎn)染組NALP3蛋白表達水平明顯下調(diào)(p＜0.05)。(3)經(jīng)缺氧復氧后，NRK-52E細胞培養(yǎng)上清液中LDH含量和NALP3蛋白表達表達顯著增加。與無關siRNA相比，LDH含量和NALP3的表達有顯著下降(P＜0.05)。(4)與對照組相比，H/R后細胞IκB-α磷酸化和降解以及NF-κBDNA結合活性增加，細胞NALP3、Bcl-2和Bax蛋白的表達明顯

5、上調(diào)，而NALP3-siRNA轉(zhuǎn)染組細胞IκB-α蛋白的降解，NF-κBDNA結合活性以及Bax/Bcl-2蛋白的比值均低于無關siRNA轉(zhuǎn)染組（均P＜0.05）。同時，與對照組相比各組細胞凋亡率明顯增多，其中NALP3-siRNA轉(zhuǎn)染組細胞凋亡率明顯低于無關siRNA轉(zhuǎn)染組（均P＜0.05）。
　　 結論：H/R使腎小管上皮細胞內(nèi)NALP3蛋白表達明顯上調(diào)。NALP3-si-RNA能夠顯著抑制腎小管上皮細胞內(nèi)NALP3的表達，