骨髓干細(xì)胞移植對(duì)馬兜鈴酸腎病大鼠模型腎小管上皮細(xì)胞分化潛能及治療作用探討.pdf

1、目的：馬兜鈴酸腎病(aristolochic acid nephropathy，AAN)是由于服用含有馬兜鈴酸(chronic aristolochic acid，AA)的中草藥導(dǎo)致的腎損害疾病，病理改變主要為腎小管萎縮消失、腎小管基底膜增厚屈曲；腎間質(zhì)片狀或彌漫性纖維化；小動(dòng)脈壁增厚、管腔狹窄；腎小球缺血性皺縮、硬化。多數(shù)為慢性AAN(chroilic adstolochicacid nephropathy，CAAN)，呈現(xiàn)典型的慢性

2、腎小管間質(zhì)腎病，而慢性腎臟疾病的進(jìn)展是一個(gè)不可逆轉(zhuǎn)的過程，最終導(dǎo)致終末期腎衰竭。 目前CAAN的發(fā)病機(jī)制尚未十分清楚，所以缺乏統(tǒng)一可靠的治療方法，深入探討AAN的發(fā)生機(jī)制，尋找新的有效預(yù)防和治療措施，控制和延緩腎衰竭進(jìn)展，是目前研究的重點(diǎn)之一。 近年來干細(xì)胞移植已成為醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。研究證明，骨髓干細(xì)胞除向血液系統(tǒng)定系分化外，還可以跨系分化為其他系統(tǒng)有功能的組織成分，包括向腎組織細(xì)胞分化，這為難治性腎臟疾病(如CAA

3、N)的治療提供了新思路。本研究通過建立CAAN動(dòng)物模型，并予以骨髓干細(xì)胞移植，旨在探討干細(xì)胞向CAAN腎臟細(xì)胞分化的潛能及對(duì)CAAN的治療作用，并進(jìn)而推斷CAAN的發(fā)病機(jī)制。 本試驗(yàn)從以下三個(gè)方面進(jìn)行了研究：①骨髓源性干細(xì)胞向慢性馬兜鈴酸腎病大鼠腎小管上皮細(xì)胞分化潛能的研究；②干細(xì)胞移植對(duì)慢性馬兜鈴酸腎病大鼠的治療作用；③干細(xì)胞移植對(duì)慢性馬兜鈴酸腎病大鼠腎組織α-SMA、CK18、TGF-β1、HGF表達(dá)的影響。 材料與

4、方法： 第一部分：雌性Wistar大鼠37只，隨機(jī)分為2組：①移植組(n=16只)，予以關(guān)木通煎劑灌胃(20g．kg<'-1>.d<'-1>，相當(dāng)于10ml．kg<'-1>．d<'-1>)，分兩次給予，每周連續(xù)用藥5天，共12周。然后予以亞致死劑量X線照射后經(jīng)尾靜脈注射途徑移植同系雄性Wistar大鼠骨髓干細(xì)胞(骨髓干細(xì)胞1×10<'8>個(gè)/只，0.35ml/只)。于尾靜脈注射干細(xì)胞后第30天、第60天分別處死8只大鼠。②非移植

5、組(n=21只)，予以關(guān)木通煎劑灌胃(20g．kg<'-1>．d<'-1>，相當(dāng)于10m1．kg<'-1>．d<'-1>)，分兩次給予，每周連續(xù)用藥5天，共12周。然后予以尾靜脈注射等量生理鹽水(0.35ml/只)，于尾靜脈注射生理鹽水后第30天、第60天分別處死8只大鼠。其中隨機(jī)選取5只大鼠于注射生理鹽水前與移植組一起接受x線照射，并于第30天時(shí)處死5只大鼠。另設(shè)正常對(duì)照組(n=5只)：均為雄性Wistar大鼠，自由進(jìn)食水，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)

6、全部處死。大鼠在處死時(shí)留取腎組織標(biāo)本。本部分用連續(xù)切片做免疫熒光(IF)染色結(jié)合Y染色體熒光原位雜交(Y-FISH)方法，主要觀察移植組大鼠腎組織中骨髓源性干細(xì)胞的分化情況。非移植組(第30天時(shí))，腎組織切片做HE染色觀察X線照射對(duì)腎組織病理改變的影響。 第二部分：雌性Wistar大鼠40只，隨機(jī)分為3組：①移植組(n=16只)，予以關(guān)木通煎劑灌胃(20g．kg<'-1>．d<'-1>，相當(dāng)于10m1．kg<'-1>．d<'-1

7、>)，分兩次給予，每周連續(xù)用藥5天，共12周。然后予以亞致死劑量X線照射后經(jīng)尾靜脈注射途徑移植同系雄性Wistar大鼠骨髓干細(xì)胞(骨髓干細(xì)胞1×10<'8>個(gè)/只，0.35ml/只)。于尾靜脈注射干細(xì)胞后第30天、第60天分別處死8只大鼠。②非移植組(n=16只)，予以關(guān)木通煎劑灌胃(20g．kg<'-1>．d<'-1>，相當(dāng)于10m1．kg<'-1>．d<'-1>)，分兩次給予，每周連續(xù)用藥5天，共12周。然后予以尾靜脈注射等量生理鹽

8、水(0.35ml/只)。于尾靜脈注射生理鹽水后第30天、第60天分別處死8只大鼠。③正常對(duì)照組(n=8只)，予以飲用水10ml．kg<'-1>．d<'-1>(分兩次給予)灌胃，每周連續(xù)5天，共12周，然后經(jīng)尾靜脈注射等量生理鹽水(0.35ml/只)。并于尾靜脈注射生理鹽水后第60天處死8只大鼠。大鼠在處死前留尿測(cè)24小時(shí)尿蛋白定量、處死時(shí)留取血、尿標(biāo)本。做血尿素氮、肌酐、血紅蛋白、尿β<,2>-MG、尿NAG檢測(cè)。觀察各組大鼠臨床相關(guān)指

9、標(biāo)的動(dòng)態(tài)變化。 第三部分：雌性Wistar大鼠40只，隨機(jī)分為3組：①移植組(n=16只)，予以關(guān)木通煎劑灌胃(20g．kg<'-1>．d<'-1>，相當(dāng)于10ml．kg<'-1>．d<'-1>)，分兩次給予，每周連續(xù)用藥5天，共12周。然后予以亞致死劑量X線照射后經(jīng)尾靜脈注射途徑移植同系雄性Wistar大鼠骨髓干細(xì)胞(骨髓干細(xì)胞1×10<'8>個(gè)/只，0.35ml/只)。于尾靜脈注射干細(xì)胞后第30天、第60天分別處死8只大鼠。

10、②非移植組(n=16只)，予以關(guān)木通煎劑灌胃(20g．kg<'-1>．d<'-1>，相當(dāng)于10ml．kg<'-1>．d<'-1>)，分兩次給予，每周連續(xù)用藥5天，共12周。然后予以尾靜脈注射等量生理鹽水(0.35ml/只)。于尾靜脈注射生理鹽水后第30天、第60天分別處死8只大鼠。③正常對(duì)照組(n=8只)，予以飲用水10ml．kg<'-1>．d<'-1>(分兩次給予)灌胃，每周連續(xù)5天，共12周，然后經(jīng)尾靜脈注射等量生理鹽水(0.35m

11、l/只)。并于尾靜脈注射生理鹽水后第60天處死8只大鼠。大鼠在處死時(shí)留取腎組織標(biāo)本。做HE及Masson染色，光鏡觀察干細(xì)胞移植前后CAAN大鼠腎臟組織形態(tài)學(xué)變化情況；電鏡觀察腎小管上皮細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)變化；應(yīng)用免疫組化方法檢測(cè)移植前后腎臟αc-SMA、CK18、 TGF-β<,1>和HGF表達(dá)的變化；RT-PCR方法檢測(cè)移植前后α-SMA、CK18、TGF-β<,1>和HGF的mRNA表達(dá)變化；Western blot技術(shù)檢測(cè)移植前后α

12、-SMA、CK18、FGF-β<,1>和HGF的蛋白表達(dá)變化。數(shù)據(jù)處理：采用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件分析處理，計(jì)量數(shù)據(jù)x±s表示，組間差異采用單因素方差分析，P<0.05為有顯著性差異。 結(jié)果： 第一部分：①正常對(duì)照組：雄性大鼠腎組織切片經(jīng)Y-FISH檢測(cè)觀察到Y(jié)染色體陽性(Y<'+>，黃綠色熒光亮點(diǎn))雜交細(xì)胞。②非移植組：雌性CAAN大鼠，生理鹽水注射后第30天及第60天腎組織切片經(jīng)Y-FISH檢測(cè)均未觀察到Y(jié)<'+>

13、雜交細(xì)胞。③移植組：在骨髓干細(xì)胞移植后第30天、第60天時(shí)，大鼠腎組織切片經(jīng)Y-FISH檢測(cè)亦觀察到Y(jié)<'+>雜交細(xì)胞，同時(shí)連續(xù)切片做免疫熒光染色檢測(cè)觀察到其表達(dá)腎小管上皮細(xì)胞的表型特征CKl8和RCA Ⅰ(CK18<'+>、RCA Ⅰ<'+>)。④非移植組(第30天時(shí))經(jīng)X線照射和未照射大鼠腎組織切片做HE染色：結(jié)果未發(fā)現(xiàn)兩組大鼠形態(tài)結(jié)構(gòu)存在明顯差異，說明該劑量X線照射對(duì)CAAN腎臟無特殊影響。 第二部分：腎功能測(cè)定結(jié)果：非移

14、植組BUN、Cr逐漸升高，第30天、第60天時(shí)BUN值分別為19.25±4.26、25.04±6.5，與正常對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P<0.01；移植組BUN、Cr明顯降低，第30天、第60天時(shí)BUN值分別為11.47±3.19、9.71±3.74，與非移植組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P<0.01但仍高于正常對(duì)照組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P<0.01。 第三部分：腎臟病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)非移植組損傷嚴(yán)重、腎間質(zhì)纖維化明顯，腎間質(zhì)纖維化面積于第30天、

15、第60天分別為0.20±0.016、0.25±0.02，經(jīng)干細(xì)胞移植后損傷減輕、無明顯纖維化，纖維化面積分別為0.13±0.006、0.12±0.005，與正常對(duì)照組和移植組相比，非移植組大鼠腎間質(zhì)纖維化面積明顯增加P<0.01；電鏡觀察移植組腎小管上皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)較對(duì)照組明顯改善。 結(jié)論： 本研究結(jié)果表明： (1)移植組(第30天、第60天)和正常對(duì)照組(雄性)大鼠腎組織切片經(jīng)Y-FISH檢測(cè)均觀察到Y(jié)染色體陽

16、性雜交細(xì)胞，而非移植組雌性CAAN大鼠腎組織切片經(jīng)Y-FISH檢測(cè)未觀察到Y(jié)<'+>細(xì)胞；同時(shí)，移植組大鼠腎組織切片經(jīng)免疫熒光檢測(cè)觀察到這些Y<'+>細(xì)胞部分表達(dá)腎小管上皮細(xì)胞的表型特征CK18和RCA Ⅰ(CK8<'+>、RCA Ⅰ<'+>)。證明骨髓源性干細(xì)胞具有向CAAN大鼠腎臟小管上皮細(xì)胞分化的潛能。 (2)骨髓干細(xì)胞移植可以明顯改善CAAN大鼠的腎功能、提高血紅蛋白水平、減少24小時(shí)尿蛋白和β<,2>-MG的丟失、降低

17、尿NAG含量。說明骨髓干細(xì)胞移植對(duì)CAAN有治療作用。這不僅給CAAN的治療開拓干細(xì)胞治療的新途徑，而且也為其他原因所致的腎衰竭的治療帶來新的希望。 (3)骨髓干細(xì)胞移植能明顯減輕CAAN大鼠腎臟病理?yè)p害，減輕腎間質(zhì)纖維化；降低腎臟α-SMA、TGF-β1蛋白和mRNA表達(dá)，提高腎臟CK18、HGF蛋白和mRNA的表達(dá)；從而在細(xì)胞和細(xì)胞因子水平，證明骨髓干細(xì)胞移植能減輕腎損害和腎間質(zhì)纖維化。這將為CAAN甚至其他腎小管間質(zhì)纖維化