腎小管上皮細(xì)胞有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)和功能變化及其在馬兜鈴酸腎病中的作用研究.pdf

1、本課題旨在從OATs角度探討AA腎臟轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制，為進(jìn)一步研究AAN易感機(jī)制奠定基礎(chǔ)。 實(shí)驗(yàn)一．大鼠腎臟缺血再灌注損傷后腎小管上皮細(xì)胞有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)和功能變化目的探討大鼠腎臟缺血再灌注損傷后腎小管上皮細(xì)胞有機(jī)陰離子蛋白(OAT)1和3表達(dá)及功能變化。 方法:建立大鼠缺血再灌注腎損傷模型，于術(shù)后第1、2、4、6天取血及腎組織標(biāo)本。處死前股靜脈插管輸注PAH，股動(dòng)脈插管取血，膀胱插管留尿。用RT-PCR檢測(cè)OAT1／3

2、 mRNA表達(dá)。分別用免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)腎臟組織OAT1和3蛋白表達(dá)；提取腎皮質(zhì)勻漿和基側(cè)膜蛋白用Western blot檢測(cè)腎臟組織OAT1和3蛋白表達(dá)；毛細(xì)血管電泳儀檢測(cè)腎臟對(duì)氨基馬尿酸(PAR)排泄率；采用試劑盒測(cè)定腎皮質(zhì)基側(cè)膜Na，K-ATPase活性；并行常規(guī)血肌酐濃度測(cè)定及腎臟組織形態(tài)學(xué)觀察。另設(shè)假手術(shù)組作對(duì)照。 結(jié)論:腎缺血再灌注導(dǎo)致腎小管損傷早期，腎小管OATl和3表達(dá)升高而PAR排泄率下降。Na-K-ATPa

3、se活性下降和OAT1和3分布異常可能是其功能下降的主要機(jī)制。及時(shí)去除致病因素、避免內(nèi)源性及外源性藥物及毒素加重小管負(fù)擔(dān)，對(duì)于損傷后小管功能的恢復(fù)可能具有重要意義 實(shí)驗(yàn)二．有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1在馬兜鈴酸腎細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)及其細(xì)胞毒性中的作用目的探討有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白I(OAT1)在馬兜鈴酸I(AAI)腎細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)中的作用及其毒效關(guān)系。 方法：體外構(gòu)建重組大鼠OAT1(rOAT1)基因的真核表達(dá)質(zhì)粒，將rOAT1重組質(zhì)粒導(dǎo)入人胚腎細(xì)

4、胞(HRK 293)。觀察rOATl對(duì)對(duì)氨基馬尿酸(PAH)攝取的影響及動(dòng)力學(xué)曲線。觀察rOAT1及rOAT1阻斷對(duì)AAI攝取的影響及動(dòng)力學(xué)曲線。并分別觀察不同濃度AAI對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞caspase 3 mRNA和細(xì)胞凋亡的影響。Westernblot檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞rOAT1表達(dá)；毛細(xì)管電泳法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)PAR濃度；高效液相色譜法(HPLC)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)從濃度。RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞caspase 3 mRNA表達(dá)，流式細(xì)胞法(Annexin V-

5、FITC)檢測(cè)細(xì)胞凋亡水平。 結(jié)論:轉(zhuǎn)染含rOATI質(zhì)粒的HEK-293細(xì)胞特異性表達(dá)rOATl。AAI呈濃度依賴性和時(shí)間依賴性進(jìn)入rOAT1轉(zhuǎn)染細(xì)胞，并呈劑量依賴性誘導(dǎo)OAT1表達(dá)細(xì)胞凋亡。提示OATl特異性介導(dǎo)AAI腎細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)及細(xì)胞毒性。 實(shí)驗(yàn)三．馬兜鈴酸腎病患者腎組織OAT1表達(dá)及其與腎間質(zhì)纖維化相關(guān)性研究目的探討急性和慢性馬兜鈴酸腎病患者腎臟組織0AT1的表達(dá)水平、調(diào)節(jié)因素及其與腎小管間質(zhì)纖維化的相關(guān)性。z方法

6、1997.1-2007.5中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院確診為馬兜鈴酸腎病患者腎活檢組織標(biāo)本(n=10)和外科手術(shù)切除腎臟遠(yuǎn)離病灶部位的正常腎組織(n=5)。利用免疫組織化學(xué)技術(shù)進(jìn)行腎臟組織OAT1、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、纖維連接蛋白(FN)和α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)染色，應(yīng)用圖像分析儀進(jìn)行半定量積分。 結(jié)論:馬兜鈴酸腎病患者腎組織OAT1表達(dá)明顯降低。從導(dǎo)致腎小管損傷后，可能通過(guò)EGF下調(diào)而導(dǎo)致OAT1表達(dá)降低；而OAT1表達(dá)

7、下調(diào)，可能引起AA腎臟轉(zhuǎn)運(yùn)清除低下，腎問(wèn)質(zhì)AA蓄積誘導(dǎo)間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化和間質(zhì)纖維化。 綜上所述，我們得出以下結(jié)論： 1.急性腎缺血再灌注導(dǎo)致腎小管損傷早期，腎小管OAT1和3表達(dá)升高而PAH排泄率下降。Na，K-ATPase活性下降、0AT1和3分布異常可能是其功能下降的主要機(jī)制。提示腎臟損傷時(shí)可能通過(guò)0AT1和3表達(dá)和功能變化對(duì)腎臟藥物和毒素清除產(chǎn)生影響。 2.轉(zhuǎn)染含rOAT1質(zhì)粒的HEK-293細(xì)胞特異性表達(dá)r