腎臟局部病理改變和腎小管上皮細(xì)胞受損在腎結(jié)石形成中的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、一、研究目的： 1、通過觀察不同結(jié)石成分腎結(jié)石患者腎乳頭的組織病理學(xué)特點(diǎn)和鈣鹽沉積特點(diǎn),分析局部病理改變與鈣鹽沉著在腎結(jié)石形成中的作用；通過檢測成骨性蛋白骨橋蛋白、骨形成蛋白-2(BMP-2)和II型膠原在腎結(jié)石患者腎組織的表達(dá),以驗(yàn)證我們關(guān)于腎結(jié)石患者腎組織鈣鹽沉積的形成可能也是一種成骨性反應(yīng)的猜測,探討腎鈣鹽沉積的機(jī)制； 2、通過觀察不同濃度草酸、COM結(jié)晶對體外培養(yǎng)的人近端腎小管上皮細(xì)胞(HK-2)的毒性損傷和蛋白

2、表達(dá)的影響,探討上皮細(xì)胞受損在腎結(jié)石形成過程中的可能作用； 3、通過雙向凝膠電泳結(jié)合質(zhì)譜分析,鑒定HK-2細(xì)胞在受到草酸、COM結(jié)晶損傷后表達(dá)的差異蛋白質(zhì),并推測和討論這些蛋白質(zhì)在HK-2細(xì)胞受損和腎結(jié)石形成中的可能作用,為進(jìn)一步深入研究腎結(jié)石的形成機(jī)制提供新的研究思路和方向。 二、研究內(nèi)容： 1、采用傅立葉轉(zhuǎn)換紅外光譜測定結(jié)石成分；對接受經(jīng)皮腎鏡取石碎石術(shù)(PCNL術(shù))的腎結(jié)石患者,于術(shù)中直視下獲取腎乳頭活檢標(biāo)

3、本,行HE染色和茜素紅染色,光鏡和電鏡下觀察其組織病理學(xué)特點(diǎn)；采用免疫組化檢測骨橋蛋白、BMP-2和II型膠原在腎結(jié)石患者腎組織的表達(dá)情況,并與正常腎組織比較。 2、體外培養(yǎng)HK-2細(xì)胞,待細(xì)胞長滿后,換成無血清含鈣DMEM培養(yǎng)液,使細(xì)胞處于靜止期；分別在培養(yǎng)基中加入不同終濃度(1 mM、2 mM、3 mM、5 mM和10 mM)草酸、(200mg/L、500mg/L和1000mg/L)COM結(jié)晶或(1 mM、2 mM、3 mM

4、、5 mM和10 mM)草酸+200mg/L COM結(jié)晶,作用4h、12h及24h后,以CCK-8試劑盒檢測上述結(jié)石成分對HK-2細(xì)胞的毒性作用；通過Bradford蛋白濃度測定試劑盒檢測HK-2細(xì)胞受不同濃度(1 mM、2 mM、5 mM和10 mM)草酸或(1 mM、2 mM、5 mM和10 mM)草酸+200mg/L COM結(jié)晶作用后,細(xì)胞表達(dá)的總蛋白量的變化。 3、篩選受草酸和COM結(jié)晶損傷后HK-2細(xì)胞的差異蛋白表達(dá)譜

5、：利用雙向凝膠電泳技術(shù)對正常HK-2細(xì)胞和與2mM草酸+200mg/L COM結(jié)晶共孵育12小時后的HK-2細(xì)胞總蛋白進(jìn)行電泳分離,獲得相應(yīng)蛋白質(zhì)譜。Image Master Platinum5.0圖形分析軟件對凝膠圖譜進(jìn)行分析,篩選出正常HK-2細(xì)胞和與草酸+COM結(jié)晶孵育后細(xì)胞間的差異蛋白質(zhì)點(diǎn)。 4、使用Finnigan線性離子阱串聯(lián)質(zhì)譜儀(LTQ)對部分差異表達(dá)蛋白點(diǎn)進(jìn)行液相色譜一串聯(lián)質(zhì)譜分析(LC-ESI-MS/MS);

6、從所鑒定出來的差異蛋白點(diǎn)選擇2種蛋白EN01和Cofilin-1,用Western blotting驗(yàn)證其在正常HK-2細(xì)胞和受損HK-2細(xì)胞中的表達(dá)情況；通過檢索數(shù)據(jù)庫,對所鑒定出來的蛋白質(zhì)進(jìn)行亞細(xì)胞定位和功能分析,并對這些蛋白在腎小管上皮細(xì)胞受損和腎結(jié)石形成中的可能作用進(jìn)行推測和討論。 三、結(jié)果： 1、部分腎結(jié)石患者的腎臟可見腎乳頭鈣斑；活檢標(biāo)本的組織病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)局部有鈣鹽沉積。鈣鹽沉積的鏡下特點(diǎn)：在鈣鹽聚集較多的

7、組織切片,鈣鹽鏡下表現(xiàn)為結(jié)節(jié)狀或片狀,可見于腎小管基底膜和間質(zhì)組織；而在鈣鹽較少的組織標(biāo)本,鈣鹽僅見于腎小管基底膜,或呈顆粒狀由腎小管基底膜向間質(zhì)蔓延；當(dāng)鈣鹽突破尿路上皮進(jìn)入集合系統(tǒng)后,其上可見小結(jié)石生長。 免疫組織化學(xué)檢查表明：腎結(jié)石患者腎組織中的腎小管上皮細(xì)胞可見骨橋蛋白呈陽性表達(dá),而腎結(jié)石患者腎組織和正常腎組織均未見BMP-2和II型膠原明顯表達(dá)。 2、細(xì)胞毒性檢測表明,草酸和/或COM結(jié)晶對HK-2的毒性作用呈明

8、顯濃度依賴性,但在不同的濃度與作用時間對HK-2作用不同。蛋白含量檢測表明：1mM、2mM和5mM草酸作用12h后,HK-2表達(dá)的蛋白量增加,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05);而受10mM草酸或10mM草酸+200mg/L COM結(jié)晶作用12h后,HK-2表達(dá)的蛋白量則顯著減少(分別為263.75±75.77ug/ml vs 328.75±60.34ug/ml,227.5±54.97ug/ml vs328.75±60.34ug/ml,P

9、<0.05);2mM草酸+200mg/L COM結(jié)晶作用12h后,HK-2表達(dá)的蛋白量稍高于正常HK-2細(xì)胞,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(332.5±51.48ug/ml vs328.75±60.34ug/ml,P>0.05)。 3、成功建立正常HK-2細(xì)胞和受2mM草酸+200mg/L COM結(jié)晶作用12小時后的HK-2細(xì)胞總蛋白的雙向凝膠電泳圖譜,實(shí)驗(yàn)組凝膠最后共得到2204±84個蛋白點(diǎn),正常細(xì)胞組即對照組最后共得到2347±57個蛋

10、白點(diǎn)。經(jīng)軟件分析,實(shí)驗(yàn)組凝膠與對照組凝膠比較共找到可信差異表達(dá)蛋白點(diǎn)16個。其中實(shí)驗(yàn)組表達(dá)上調(diào)的有9個,表達(dá)下調(diào)的有7個。 4、差異蛋白點(diǎn)利用LC-ESI-MS/MS技術(shù)進(jìn)行了質(zhì)譜鑒定,最后共有12個蛋白質(zhì)點(diǎn)得到了鑒定。有許多研究表明這些蛋白參與了細(xì)胞的能量代謝、細(xì)胞增殖、凋亡、鈣離子通道活性調(diào)控、細(xì)胞運(yùn)動及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等多種生理功能。Western blotting檢測證實(shí)了受損HK-2細(xì)胞中EN01蛋白表達(dá)升高,而Cofilin

11、-1表達(dá)降低。 四、結(jié)論： 1、腎結(jié)石患者鈣鹽沉積最初可能形成于腎小管基底膜,并向間質(zhì)擴(kuò)展。鈣鹽在腎結(jié)石形成中至少起到了以下作用：①鈣鹽突破上皮進(jìn)入集合系統(tǒng),可作為結(jié)晶粘附、聚集和生長的平臺；②脫落到集合系統(tǒng)的鈣鹽可作為結(jié)石形成的核心：③鈣鹽與局部細(xì)胞相互作用,影響腎結(jié)石的形成。 2、腎結(jié)石患者腎組織表達(dá)骨橋蛋白,而不表達(dá)BMP-2和II型膠原,因此鈣鹽的形成可能并不是一種類似于動脈鈣化的成骨性反應(yīng)。 3

12、、草酸、COM結(jié)晶在不同的濃度與作用時間對HK-2細(xì)胞產(chǎn)生不同程度的毒性作用。 4、高濃度草酸和COM結(jié)晶可使正常人HK-2細(xì)胞的蛋白表達(dá)發(fā)生改變,這些蛋白的功能涉及能量代謝、細(xì)胞增殖和凋亡、細(xì)胞運(yùn)動、鈣離子通道活性調(diào)節(jié)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白合成調(diào)節(jié)和細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)等多方面,既可起到細(xì)胞的自我保護(hù)作用,又可能通過相應(yīng)途徑在腎結(jié)石的形成過程中起重要作用,對這些蛋白與腎結(jié)石關(guān)系的進(jìn)一步探討,有望發(fā)現(xiàn)影響腎結(jié)石形成的新的作用途徑和機(jī)制。