腎臟疾病狀態(tài)下金納米粒對(duì)腎小管上皮細(xì)胞的損傷及其機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　金納米粒（gold nanoparticles，GNPs）由于制備簡(jiǎn)單、理化性質(zhì)穩(wěn)定、光學(xué)性質(zhì)可控以及無(wú)顯著毒性等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。但是近年研究發(fā)現(xiàn)金納米粒在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用仍然存在著許多不確定的因素，且對(duì)機(jī)體主要排泄器官-腎臟的相關(guān)研究較少，特別是疾病狀態(tài)下的毒理作用尚未見(jiàn)報(bào)道。顯然，開(kāi)展相關(guān)研究對(duì)于加快GNPs臨床應(yīng)用具有重要意義。
　　慢性腎臟病(chronic kidney disea

2、se，CKD)是一組具有高患病率、高死亡率的嚴(yán)重威脅人類(lèi)生命健康的慢性進(jìn)展性疾病。腎小管損傷以及間質(zhì)纖維化是慢性腎臟病腎功能減退的關(guān)鍵因素。值得注意的是:藥物及毒物性腎損傷多累及腎小管上皮細(xì)胞;缺氧是細(xì)胞最常見(jiàn)的病理狀態(tài)，腎臟病變時(shí)，腎小管上皮細(xì)胞常存在缺氧?；诖耍覀兲岢霰狙芯考僬f(shuō):腎臟病時(shí)腎小球?yàn)V過(guò)膜損傷，GNPs進(jìn)入尿液增加，繼之被腎小管上皮細(xì)胞重吸收，從而對(duì)后者造成損傷;若伴有缺氧，GNPs將加重腎小管上皮細(xì)胞損傷，并促進(jìn)小管

3、間質(zhì)纖維化。為了驗(yàn)證上述假說(shuō)，本研究應(yīng)用阿霉素腎病小鼠模型和體外細(xì)胞培養(yǎng)的腎小管上皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞，借助多種手段，觀察GNPs對(duì)腎小管上皮細(xì)胞的損傷作用，并探討相關(guān)機(jī)制。
　　方法:
　　1.用化學(xué)還原法制備粒徑分別為5nm和13nm的GNPs，并用TEM、DLS和UV—vis光譜等表征手段對(duì)其進(jìn)行表征。
　　2.通過(guò)單次鼠尾靜脈注射阿霉素構(gòu)建阿霉素腎病小鼠模型，以正常的BALB/C小鼠作為對(duì)照，將5nm和13nm的G

4、NPs通過(guò)尾靜脈注射至小鼠體內(nèi)，采用電感耦合等離子體質(zhì)譜(inductively coupled plasma mass spectrometry，ICP-MS)、病理組織切片、透射電鏡切片、TUNEL凋亡染色等方法研究納米粒在小鼠體內(nèi)的吸收、分布，并觀察其對(duì)阿霉素腎病小鼠腎臟的損傷情況。
　　3.GNPs處理缺氧培養(yǎng)的人腎小管上皮細(xì)胞，觀察腎小管上皮細(xì)胞攝取金納米粒、細(xì)胞的增殖活性變化，并檢測(cè)細(xì)胞自噬、凋亡和氧化應(yīng)激水平。

5、>　　4.用GNPs處理缺氧培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞，收集培養(yǎng)上清，繼之用培養(yǎng)上清處理腎小管上皮細(xì)胞，觀察GNPs對(duì)缺氧的巨噬細(xì)胞NLRP3炎性小體激活以及產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)對(duì)腎小管上皮細(xì)胞上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化(epithelial mesenchymaltransition, EMT)的影響。
　　結(jié)果:
　　1.成功合成了符合要求的粒徑5nm和13nm、大小均勻、分散性良好、性質(zhì)穩(wěn)定的金納米顆粒，滿(mǎn)足了后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。
　　2.通過(guò)單

6、次鼠尾靜脈注射10mg/kg阿霉素成功建立了阿霉素腎病小鼠模型。ICP-MS檢測(cè)結(jié)果顯示，5nm GNPs經(jīng)靜脈注射至阿霉素腎病小鼠后在其腎臟內(nèi)的聚集增加。組織學(xué)和透射電鏡研究發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組腎臟易見(jiàn)腎小管上皮細(xì)胞水腫（顆粒變性和空泡變性）以及蛋白管型。TUNEL染色證實(shí)5nm GNPs增加阿霉素腎病小鼠腎小管上皮細(xì)胞凋亡。
　　3.光鏡及透射電鏡檢查均發(fā)現(xiàn)，GNPs更易聚集于缺氧細(xì)胞內(nèi)，并伴有自噬體和空泡形成增加。CCK-8和LDH

7、檢查結(jié)果顯示，5nm GNPs在缺氧HK-2細(xì)胞內(nèi)的聚集能夠造成細(xì)胞生存力降低，加重細(xì)胞膜的破壞，促進(jìn)細(xì)胞中LDH的漏出。AnnexinⅤ-FITC/PI雙染檢測(cè)顯示，5nm的GNPs(50 nM)可以有效地誘導(dǎo)缺氧HK-2細(xì)胞凋亡。TEM和免疫熒光的結(jié)果提示，5nm的GNPs(50 nM)可促進(jìn)細(xì)胞自噬，且該作用在缺氧情況下明顯增強(qiáng)。自噬抑制劑(3-MA)處理后發(fā)現(xiàn)，在常氧條件下，自噬可抑制GNPs誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，但在缺氧時(shí)自噬可促進(jìn)

8、GNPs引起的細(xì)胞凋亡。GNPs處理后，缺氧細(xì)胞ROS水平明顯增加，線粒體膜電位顯著下降。
　　4.GNPs在缺氧的巨噬細(xì)胞內(nèi)的聚集也較常氧情況下明顯增加，聚集的GNPs能降低缺氧細(xì)胞的增殖能力，破壞缺氧細(xì)胞的細(xì)胞膜。qRT-PCR和Western Blot的結(jié)果提示，50nM GNPs在缺氧情況下可以誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞NLRP3炎性體的活化，進(jìn)而誘導(dǎo)Caspase-1和IL-1β的釋放增加，且ROS清除劑N-乙酰半胱氨酸(N-acet

9、yl-cysteine，NAC)能顯著抑制GNPs誘導(dǎo)的缺氧細(xì)胞NLRP3、Caspase-1和IL-1β的表達(dá)，說(shuō)明ROS在GNPs促進(jìn)缺氧細(xì)胞NLRP3炎性體活化中起了重要作用。Western Blot和免疫熒光的結(jié)果顯示，5nm的GNPs(50nM)誘導(dǎo)的缺氧巨噬細(xì)胞IL-1β的分泌可以顯著提高缺氧HK-2細(xì)胞間皮特異性標(biāo)記α-SMA表達(dá)率，而降低上皮特異性標(biāo)志物E-cad的表達(dá)。z-VAD-fmk可顯著抑制GNPs誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞

10、Caspase-1和IL-1β產(chǎn)生，同時(shí)該抑制劑還可使HK-2細(xì)胞α-SMA的表達(dá)顯著降低，而E-cadherin的表達(dá)增加。這些結(jié)果共同提示5nm的GNPs(50nM)誘導(dǎo)的缺氧巨噬細(xì)胞IL-1β的分泌可以促進(jìn)缺氧腎小管上皮細(xì)胞EMT的發(fā)生。
　　結(jié)論:
　　1.阿霉素腎病小鼠腎臟內(nèi)5nm GNPs聚集增多，提示腎臟疾病狀態(tài)下GNPs更易蓄積于腎臟，從而加劇腎臟損傷，且這一作用可能是通過(guò)促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞水腫和凋亡而實(shí)現(xiàn)。

11、
　　2.常氧情況下，GNPs進(jìn)入細(xì)胞后可誘導(dǎo)細(xì)胞自噬，使受損蛋白、細(xì)胞器等降解以維持細(xì)胞生存;而在缺氧情況下，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的納米粒增加，誘導(dǎo)過(guò)度自噬，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。ROS的明顯增加和線粒體膜電位的顯著下降可能是GNPs促進(jìn)缺氧細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。
　　3.缺氧情況下，GNPs在巨噬細(xì)胞內(nèi)亦聚集增加，可引起細(xì)胞增殖活性下降并誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞炎性體的活化，進(jìn)而誘導(dǎo)炎癥反應(yīng);而GNPs誘導(dǎo)的缺氧巨噬細(xì)胞IL-1β的分泌可以促進(jìn)缺氧腎小