Ca2+激活ROS-NFκB信號通路介導腎小管上皮細胞黏附分子表達在腎結(jié)石形成中的意義.pdf

1、第一部分遺傳性高鈣尿結(jié)石形成大鼠腎臟 miRNA-mRNA表達網(wǎng)絡分析
　　目的：全面了解遺傳性高鈣尿結(jié)石形成大鼠腎臟miRNA及mRNA的表達變化及其相互作用關(guān)系。
　　方法：采用高通量miRNA及mRNA生物芯片技術(shù)，尋找出在遺傳性高鈣尿結(jié)石形成大鼠（GHS大鼠）與Sprague-Dawley大鼠（SD大鼠）腎臟差異表達的miRNA及mRNA。通過miRanda數(shù)據(jù)庫，預測miRNA的靶基因，選取預測的靶基因與實際表達差

2、異的交集基因進行生物信息學的分析。通過GO分析和KEGGpathways分析尋找差異基因可能富集的功能和信號通路，并最終根據(jù)差異miRNA和mRNA構(gòu)建出miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡和細胞信號通路調(diào)控網(wǎng)絡（signal-net）。
　　結(jié)果：通過生物芯片檢測，共發(fā)現(xiàn)2418個在GHS大鼠和SD大鼠腎臟內(nèi)差異表達的mRNA和19個差異表達的miRNA。選取miRNA的預測靶基因和2418個差異表達基因的交集做GO和KEGG path

3、ways分析，共得到703個明顯富集的GO terms（包括417個上調(diào)和286個下調(diào)）以及83個明顯富集的pathways（包括75個上調(diào)和18個下調(diào)）。成功構(gòu)建miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡，通過網(wǎng)絡分析發(fā)現(xiàn)，rno-miR-674-5p, rno-miR-672-5p, rno-miR-138-5p and rno-miR-21-3p可能是調(diào)控網(wǎng)絡的核心，而Sema5a, Lpin2, Gcnt1, Masp1, Olr1和Traf

4、3等基因在網(wǎng)絡中有最高的連接度。此外，還成功構(gòu)建差異表達的細胞信號通路網(wǎng)絡，并發(fā)現(xiàn)NFκB家族分子在特發(fā)性高鈣尿大鼠腎臟細胞信號通路調(diào)節(jié)中發(fā)揮核心作用。
　　結(jié)論：本研究成功鑒定了GHS大鼠腎臟內(nèi)差異表達的miRNA和mRNA，并構(gòu)建了GHS大鼠腎臟miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡和信號通路網(wǎng)絡，為特發(fā)性高鈣尿結(jié)石病腎臟基因水平發(fā)生的改變提供了一個全局觀；同時也發(fā)現(xiàn)miRNA可能在該病病理生理過程中發(fā)揮重要作用，而NFκB信號通路及其

5、下游分子的改變則是該病的核心。本項目為今后關(guān)于特發(fā)性高鈣尿結(jié)石病的深入研究提供了方向。
　　第二部分 Ca2+激活腎小管上皮細胞 ROS/NFκB信號通路促進細胞黏附分子表達
　　目的：探討高鈣尿環(huán)境對腎小管上皮細胞表面黏附分子表達和草酸鈣晶體黏附的影響及其作用機制
　　方法：取GHS大鼠及SD大鼠腎臟組織，采用qRT-PCR，western blot，免疫組化檢測大鼠腎臟組織細胞內(nèi)黏附分子 ICAM-1，VCAM-1

6、及 IL-6的表達水平，用ELISA方法檢測大鼠血漿ICAM-1，VCAM-1及IL-6水平；并用western blot檢測NFκB相關(guān)分子p65和IκB表達水平和磷酸化水平；腹腔注射乙醛酸誘導大鼠腎臟成石，von-kossal染色觀察草酸鈣晶體在腎小管管腔內(nèi)的黏附情況。酶消化貼壁法培養(yǎng)GHS大鼠原代腎小管上皮細胞，并用流式細胞術(shù)鑒定細胞表面免疫標記CK-18，CK-19及E-cadherin。用Ca2+處理GHS大鼠原代腎小管上皮細

7、胞和NRK-52E細胞，鈣離子探針觀察Ca2+內(nèi)流情況；活性氧（ROS）探針觀察細胞內(nèi)ROS生成情況；qRT-PCR，western blot檢測黏附分子表達水平和NFκB相關(guān)分子表達水平和磷酸化水平；免疫熒光檢測p65表達分布變化；草酸鈣懸液孵育細胞，觀察細胞表面晶體黏附情況；透射電鏡觀察Ca2+處理前后細胞微結(jié)構(gòu)改變。分別用ROS清除劑NAC和NFκB核轉(zhuǎn)運抑制劑BAY11-7082預處理細胞，之后用Ca2+處理細胞，觀察細胞內(nèi)上述

8、指標變化，旨在證實細胞內(nèi)ROS生成和NFκB信號通路在Ca2+刺激誘導的細胞粘附分子表達和草酸鈣晶體黏附過程中的作用。
　　結(jié)果：GHS大鼠腎臟組織內(nèi)黏附分子ICAM-1，VCAM-1及IL-6的表達水平明顯高于普通SD大鼠，GHS血清中ICAM-1，VCAM-1及IL-6的表達也明顯高于SD大鼠；western blot檢測結(jié)果顯示，GHS大鼠腎臟組織內(nèi)p65和IκBα磷酸化水平明顯增高，乙醛酸誘導GHS大鼠腎小管內(nèi)草酸鈣晶體生

9、成明顯多于SD大鼠。成功培育GHS大鼠原代腎小管上皮細胞。高鈣環(huán)境可促使細胞內(nèi)Ca2+含量增加，并誘導細胞內(nèi)ROS產(chǎn)生增加。Ca2+還能促進細胞黏附分子表達增加，促進NFκB信號通路相關(guān)分子p65和IκBα的磷酸化及p65的核轉(zhuǎn)運。NAC能降低細胞內(nèi)的ROS的水平，并抑制NFκB分子的磷酸化，細胞黏附分子的表達和草酸鈣晶體在細胞表面的黏附。BAY11-7082亦可以抑制NRK-52E細胞黏附分子的表達和草酸鈣晶體在細胞表面的黏附。