STAT3乙?；谀I小管上皮細胞功能改變及腎臟纖維化中作用機制的研究.pdf

1、腎臟纖維化作為慢性腎臟病(chronic kidney disease，CKD)的常見病理特征主要表現(xiàn)為腎小球硬化和腎小管間質(zhì)纖維化。腎臟纖維化的進程可引起功能性腎實質(zhì)的持續(xù)性損失，最終導致終末期腎病。腎小管上皮細胞功能損傷是引起腎臟纖維化的眾多病因之一。Ⅱ型上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化理論認為損傷的上皮細胞能夠成為肌纖維母細胞直接前體。盡管該理論存在一定爭議，但病理條件下，腎小管上皮細胞發(fā)生轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth

2、factor-β1，TGF-β1)表達升高，細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)蛋白合成增加等變化，確實能夠參與腎間質(zhì)纖維化的發(fā)展進程。
　　本研究觀察了STAT3乙?；c磷酸化在AngⅡ引起的腎小管上皮細胞促纖維化反應及UUO引起的腎臟纖維化中的相互關系，進而從離體及整體上揭示STAT3信號通路在腎臟纖維化發(fā)展進程中的作用。實驗共分為三個部分:
　　一、STAT3的激活在AngⅡ引起的腎小管上皮細

3、胞促纖維化反應中的作用
　　1.AngⅡ引起腎小管上皮細胞促纖維化反應
　　Western blot結(jié)果顯示，AngⅡ處理腎小管上皮細胞NRK-52E48 h后，fibronectin，Ⅳ型膠原蛋白，α-平滑肌動蛋白水平顯著升高，并呈劑量依賴關系。1μM AngⅡ能夠顯著升高這些促纖維化因子的表達。
　　2.AngⅡ引起腎小管上皮細胞中STAT3的激活
　　Western blot結(jié)果顯示，AngⅡ處理能夠激活N

4、RK-52E腎小管上皮細胞中JAK2/STAT3信號通路。AngⅡ處理30 min后JAK2磷酸化上調(diào)，而STAT3 Tyr705的磷酸化也顯著升高，峰值為60 min。AngⅡ?qū)RK-52E細胞中的STAT3 Ser727磷酸化及STAT3 Lys685乙?；A水平?jīng)]有影響。
　　3.姜黃素抑制腎小管上皮細胞中STAT3乙?；傲姿峄?br>　　本實驗中使用p300及JAK2的抑制劑Curcumin觀察JAK2/STAT3信

5、號通路是否參與了AngⅡ引起的促纖維化反應。Western blot結(jié)果顯示，用curcumin(12.5μM)預處理細胞60 min能夠降低STAT3乙?；剑⒁种艫ngⅡ引起的STAT3Tyr705磷酸化水平升高。
　　4.Curcumin抑制AngⅡ引起的腎小管上皮細胞促纖維化反應
　　Western blot結(jié)果顯示，curcumin(12.5μM)預處理細胞60 min還能夠降低AngⅡ刺激48h導致的fibr

6、onectin，collagenⅣ及TGF-β1表達上調(diào)。
　　這部分的實驗結(jié)果說明STAT3參與了AngⅡ所引起的腎小管上皮細胞促纖維化反應。
　　二、STAT3 Lys685乙?；cSTAT3 Tyr705磷酸化在AngⅡ引起的腎小管上皮細胞促纖維化反應中的作用
　　1.抑制STAT3 Lys685乙?；軌蚪档虯ngⅡ引起的腎小管上皮細胞STAT3Tyr705磷酸化水平升高
　　Western blot結(jié)果

7、顯示，SIRT1激動劑Resveratrol(12.5μM)或p300 siRNA(50nM)預處理細胞60 min均能夠降低STAT3 Lys685乙酰化水平并阻斷AngⅡ刺激60 min引起的STAT3 Tyr705磷酸化水平升高，但對STAT3 Ser727的磷酸化沒有影響。而細胞免疫熒光顯示，用p300的選擇性抑制劑C646(10μM)預處理細胞60 min能夠顯著減少AngⅡ刺激60 min引起的與Tyr705磷酸化水平成正比

8、的STAT3核轉(zhuǎn)移。
　　2.抑制STAT3 Lys685乙酰化能夠減弱AngⅡ引起的腎小管上皮細胞促纖維化反應
　　Western blot結(jié)果顯示，Resveratrol(12.5 tM)或C646(10 tM)預處理細胞60min均能夠緩解AngⅡ刺激48 h導致的腎小管上皮細胞中fibronectin，collagenⅣ，TGF-β1及α-SMA表達上調(diào)。
　　3.抑制AngⅡ引起的腎小管上皮細胞STAT3 T

9、yr705磷酸化對STAT3 Lys685沒有影響
　　Western blot結(jié)果顯示，酪氨酸激酶JAK2的抑制劑AG490(12.5μM)預處理細胞60 min降低了AngⅡ刺激60 min引起的STAT3 Tyr705磷酸化，但對STAT3Ser727磷酸化及STAT3 Lys685沒有影響。
　　4.抑制腎小管上皮細胞STAT3 Tyr705磷酸化能夠減弱AngⅡ引起的腎小管上皮細胞促纖維化反應
　　Weste

10、rn blot結(jié)果顯示，細胞給予AG490(12.5μM)預處理60 min后，能夠阻斷AngⅡ刺激48 h引起的腎小管上皮細胞fibronectin表達上調(diào)。
　　5.上調(diào)腎小管上皮細胞STAT3乙?；軌蛏逽TAT3磷酸化水平，并引起下游促纖維化反應
　　5.1 Nicotinamide引起腎小管上皮細胞STAT3激活并引起促纖維化反應
　　Western blot結(jié)果顯示，SIRT抑制劑nicotinamide

11、處理細胞48 h能夠顯著升高腎NRK-52E細胞STAT3 Lys685乙酰化和STAT3Tyr705磷酸化水平，同時伴隨fibronectin、collagenⅣ表達升高，并且成劑量依賴趨勢。
　　5.2過表達p300引起腎小管上皮細胞STAT3激活并導致促纖維化反應
　　Western blot結(jié)果顯示，通過轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒過表達p30048 h顯著升高了NRK-52E細胞的p300蛋白水平，并伴隨STAT3 Lys685乙

12、酰化和STAT3Tyr705磷酸化水平的升高。另外，過表達p30048 h還能夠上調(diào)fibronectin，collagenⅣ以及TGF-β1蛋白水平。
　　這部分的實驗結(jié)果說明抑制STAT3 Lys685乙?；c降低AngⅡ引起的腎小管上皮細胞中STAT3 Tyr705磷酸化及STAT3介導的促纖維化反應密切相關。STAT3Tyr705磷酸化是AngⅡ引起的腎小管上皮細胞促纖維化反應所必須的。上調(diào)腎小管上皮細胞STAT3乙酰化水

13、平能夠上調(diào)STAT3磷酸化并引起下游促纖維化反應。
　　三、Resveratrol抑制UUO腎臟中STAT3的乙?；?、磷酸化及腎臟纖維化
　　1.UUO引起了腎臟STAT3的激活和促纖維化反應
　　Western blot結(jié)果顯示，在小鼠UUO模型中，手術一天后腎臟STAT3 Tyr705磷酸化顯著升高，但STAT3 Lys685乙酰化水平并沒有明顯變化。纖維化相關基因fibronectin，collagenⅣ及α-S

14、MA在UUO小鼠中顯著升高，從手術后三天開始表現(xiàn)出統(tǒng)計學差異，并持續(xù)到實驗終止（7天）。
　　2.Resveratrol抑制UUO引起的梗阻腎臟中STAT3的激活以及促纖維化基因的高表達
　　Western blot結(jié)果顯示，通過灌胃術給予UUO小鼠resveratrol(100mg/kg)處理能夠降低STAT3 Lys685乙?；剑⒕徑釻UO所引起的STAT3Tyr705磷酸化水平升高（1天）。Resveratrol

15、灌胃3天能夠抑制UUO引起的梗阻性腎臟中fibronectin，collagenⅣ和α-SMA蛋白水平的升高。
　　3.Resveratrol緩解UUO腎臟小管間質(zhì)纖維化
　　馬松染色及蘇木精-伊紅染色顯示了resveratrol處理后梗阻性腎臟的組織學變化。在正常與假手術的小鼠腎臟中，沒有顯著的腎間質(zhì)纖維化發(fā)生，也沒有可見的膠原染色。梗阻三天的腎臟表現(xiàn)出小管間質(zhì)纖維化和藍色的膠原沉積染色。UUO給予resveratrol治

16、療組小鼠的腎小管間質(zhì)纖維化和膠原沉積與UUO組相比顯著減少。
　　這部分實驗結(jié)果與離體細胞實驗結(jié)果一致，提示STAT3乙?；瘏⑴c了梗阻性腎病的纖維化進程。
　　綜上所述，本課題的研究結(jié)果顯示AngⅡ能夠通過激活JAK2引起腎小管上皮細胞STAT3 Tyr705磷酸化水平的升高，并進一步導致fibronectin，collagenⅣ，α-SMA的表達上調(diào);抑制STAT3 Lys685乙?；梢种艫ngⅡ引起的STAT3Tyr7

17、05磷酸化水平升高及纖維化相關基因fibronectin，collagenⅣ，TGF-β1，α-SMA的表達上調(diào);抑制STAT3 Tyr705磷酸化能夠抑制AngⅡ引起的腎小管上皮細胞fibronectin表達上調(diào)，但不影響STAT3 Lys685乙?；?上調(diào)STAT3Lys685乙?；侥軌蛲瑫r上調(diào)STAT3 Tyr705磷酸化水平并誘導下游的纖維化相關基因fibronectin，collagenⅣ，TGF-β1的表達上調(diào)。另外