脂肪干細(xì)胞來(lái)源的外來(lái)體促進(jìn)皮膚創(chuàng)傷愈合的研究.pdf

1、目的：
　　軟組織創(chuàng)傷的經(jīng)久不愈和愈合后的瘢痕形成是臨床兩大難點(diǎn)，也是研究熱點(diǎn)。最新研究發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的外來(lái)體（exosomes）在創(chuàng)傷愈合中發(fā)揮積極作用。然而，脂肪干細(xì)胞（ASCs）來(lái)源的exosomes在皮膚創(chuàng)傷修復(fù)中的作用及機(jī)制尚不清楚。本研究探討ASCs來(lái)源的exosomes對(duì)皮膚創(chuàng)傷愈合的主要效應(yīng)細(xì)胞－成纖維細(xì)胞的生物學(xué)性能的影響，為促進(jìn)軟組織創(chuàng)傷愈合以及提高修復(fù)質(zhì)量提供理論依據(jù)，也為臨床應(yīng)用提供新思路。
　

2、　方法：
　　（1）構(gòu)建小鼠背部和腹股溝相同大小創(chuàng)傷模型，比較有脂肪層的腹股溝創(chuàng)口和無(wú)脂肪層的背部創(chuàng)口愈合快慢，并且創(chuàng)口組織免疫熒光檢測(cè)exosomes標(biāo)志蛋白CD63的表達(dá)情況；
　?。?）從人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)液中提取出ASCs分泌的exosomes，采用透射電鏡，Nanosigtht，Western blot三種方法分別對(duì)其進(jìn)行形態(tài)學(xué)，直徑分布，蛋白組學(xué)的鑒定；
　?。?）將用CM-DiI熒光染料標(biāo)記過(guò)的exo

3、somes加入到成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)液，24h后熒光顯微鏡下觀察exosomes是否進(jìn)入到成纖維細(xì)胞里，參與調(diào)控成纖維細(xì)胞的生物學(xué)行為；
　　（4）用不同濃度的exosomes（0,25,50,100ug/ml）刺激成纖維細(xì)胞，利用劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)exosomes對(duì)成纖維細(xì)胞的遷移能力的影響，CCK-8法檢測(cè)對(duì)成纖維細(xì)胞增殖能力和RT-PCR法檢測(cè)對(duì)膠原合成的影響；
　　（5）構(gòu)建小鼠背部創(chuàng)傷模型，將DIR熒

4、光染料標(biāo)記的exosomes通過(guò)鼠尾靜脈注射到小鼠體內(nèi)，活體成像儀檢測(cè)exosomes是否遷移到創(chuàng)口部位，參與創(chuàng)傷愈合過(guò)程；
　　（6）采用Masson染色評(píng)估創(chuàng)口總體膠原纖維的表達(dá)情況，免疫組化檢測(cè)創(chuàng)口Ⅰ、Ⅲ型膠原的表達(dá)情況，RT-PCR檢測(cè)創(chuàng)口Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA合成情況，同時(shí)計(jì)算創(chuàng)口愈合率。
　　結(jié)果：
　?。?）發(fā)現(xiàn)含有脂肪組織的腹股溝部位創(chuàng)傷愈合更快，外來(lái)體標(biāo)志蛋白CD63免疫熒光結(jié)果顯示在該部位細(xì)胞分泌了更

5、多的外來(lái)體，發(fā)現(xiàn)脂肪組織對(duì)創(chuàng)傷愈合的積極影響，這提示可能跟exosomes有關(guān)。
　?。?）通過(guò)透射電鏡的檢測(cè)顯示提取的粒子是圓形的囊泡樣結(jié)構(gòu)并且呈現(xiàn)典型的“杯口狀”，粒子的直徑大小約85％集中分布在30-100nm之間。同時(shí)，利用NanoSight儀器動(dòng)態(tài)的觀察了外來(lái)體（exosomes）的直徑大小，濃度的檢測(cè)，以及布朗運(yùn)動(dòng)軌跡和動(dòng)態(tài)追蹤視頻截圖，結(jié)果表現(xiàn)出和透射電鏡相似的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。通過(guò)蛋白免疫印跡法顯示提取出的粒子高表達(dá)外來(lái)體

6、標(biāo)志蛋白CD63和CD9。
　?。?）體外示蹤實(shí)驗(yàn)顯示exosomes可以進(jìn)入到成纖維細(xì)胞胞漿里，提示exosomes可以被成纖維細(xì)胞攝取。
　?。?）exosomes對(duì)成纖維細(xì)胞的遷移，增殖具有明顯的促進(jìn)作用，且具有濃度依賴性；exosomes可以顯著上調(diào)成纖維細(xì)胞的Ⅰ、Ⅲ型膠原和彈性蛋白的表達(dá)，尤其是在50ug/ml這個(gè)濃度的作用最明顯。
　　（5）體內(nèi)示蹤實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)exosomes可以遷移到創(chuàng)口周圍。
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