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文檔簡介
1、細胞珠蛋白(Cytoglobin,Cygb)是Kawada等在大鼠肝星狀細胞中發(fā)現(xiàn)的一種六配位血紅素球蛋白,分子量為21.4 kDa。目前研究表明Cygb具有過氧化物酶活性和清除氧自由基的功能,并能通過調(diào)控Cygb基因的表達抑制肝纖維化。但Cygb作為一種胞漿蛋白,且在細胞表面無Cygb受體的情況下,外源Cygb無法主動進出細胞,發(fā)揮其抗氧化、抗炎癥及抗肝纖維化等生物學功能。本論文結(jié)合穿膜肽TAT的穿膜作用和Cygb的生物學功能,制備及
2、探討TAT-Cygb融合蛋白在促進皮膚創(chuàng)傷愈合及抗肝纖維化方面的作用。
首先,通過乳糖誘導表達E. coli BL21/pET22b-TAT-Cygb中的TAT-Cygb融合蛋白,經(jīng)CM陽離子交換層析、S-100分子篩層析、G-25分子篩脫鹽等分離純化過程,以及SDS-PAGE、LC/MS和Western blot鑒定,得到純度>95%、濃度為3.273 mg/mL、過氧化物酶比活力為(422.63±3.17)U/mg的TAT
3、-Cygb,并通過免疫細胞化學鑒定TAT-Cygb的穿膜能力;其次,利用H2O2氧化應激損傷模型和超氧化物陰離子熒光探針證明TAT-Cygb對細胞的保護作用和治療氧化損傷的作用,并能降低細胞內(nèi)超氧化物陰離子的水平,而無穿膜能力的Cygb無法緩解已氧化損傷的細胞;再次,利用二甲苯致小鼠耳廓腫脹模型驗證TAT-Cygb的抗炎作用,在大鼠全層皮膚切除的創(chuàng)傷愈合實驗中,TAT-Cygb可發(fā)揮抗炎作用促進皮膚創(chuàng)傷愈合,并通過調(diào)節(jié)細胞內(nèi)的氧化應激防
4、止成纖維細胞過度增殖或遷移,從而有效減輕皮膚愈合后瘢痕修復區(qū)域的大小;最后,在抗小鼠肝纖維化實驗中,高劑量的TAT-Cygb可逆轉(zhuǎn)CCl4誘導的小鼠肝纖維化,與模型組相比,肝臟內(nèi)膠原纖維含量明顯減少,肝小葉結(jié)構(gòu)恢復正常,肝功能指標和纖維化血清標志物等含量均趨于正常。
本論文首次利用TAT的穿膜能力介導Cygb進入胞內(nèi),并證明TAT-Cygb融合蛋白具有促進皮膚創(chuàng)傷愈合及抗肝纖維化的作用,為后續(xù)開展Cygb抗炎癥、抗衰老、抗肝纖
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