p75NTR陽性人食管鱗癌細(xì)胞的干細(xì)胞特性研究.pdf

1、食管腫瘤干細(xì)胞是食管癌組織中一小部分具有自我更新、無限增殖和多向分化潛能的細(xì)胞，它在食管癌組織中所占比例雖然很少，卻與食管癌發(fā)生、發(fā)展與轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。p75NTR是一種低親和性神經(jīng)營養(yǎng)素受體(neurotrophin receptor p75，p75NTR)，屬Ⅰ型跨膜TNF受體超家族成員。在以往的研究中，p75NTR曾被用來分離神經(jīng)冠干細(xì)胞，鼠脂肪多能干細(xì)胞和人角膜上皮原始祖細(xì)胞等。Okumura等研究證明正常食道上皮細(xì)胞中的p75N

2、TR+細(xì)胞具有增殖、自我更新及多向分化能力，經(jīng)鑒定為食道上皮干細(xì)胞。
　　本實(shí)驗(yàn)將采用流式細(xì)胞分選技術(shù)對(duì)食管鱗癌細(xì)胞以p75NTR為標(biāo)志進(jìn)行分選，而后將p75NTR+和p75NTR—食管鱗癌細(xì)胞進(jìn)行生物學(xué)特性研究和基因表達(dá)譜差異篩選，并以篩選出的某一差異基因?yàn)槟康幕?，通過干擾其表達(dá)后研究p75NTR+食管鱗癌細(xì)胞增殖及侵襲情況。
　　本文從以下幾部分展開論述：
　　第一部分 p75NTR陽性食管鱗癌細(xì)胞生物學(xué)特性研究

3、
　　目的：分選獲取p75NTR+食管鱗癌細(xì)胞，通過一系列實(shí)驗(yàn)探討其是否具有TSC的特性。
　　方法：以流式細(xì)胞儀分選獲取相應(yīng)p75NTR+和p75NTR—食管鱗癌細(xì)胞，而后分別進(jìn)行細(xì)胞單克隆形成能力、增殖分化能力、侵襲能力、耐藥能力、成瘤能力的對(duì)比研究試驗(yàn)，來探討p75NTR+人食管鱗癌細(xì)胞的TSC的特性。
　　結(jié)果：成功分選出p75NTR+和p75NTR—食管鱗癌細(xì)胞； p75NTR+細(xì)胞的單克隆形成能力、自我更新

4、能力、侵襲能力強(qiáng)于p75NTR—細(xì)胞；在對(duì)化療藥物的耐受能力及小鼠致瘤能力上，p75NTR+細(xì)胞明顯強(qiáng)于p75NTR—細(xì)胞。
　　結(jié)論：p75NTR+食管鱗癌細(xì)胞比p75NTR—細(xì)胞具有更強(qiáng)的侵襲性、致瘤能力及耐化療能力，可能富集食管磷癌干細(xì)胞。
　　第二部分p75NTR陽性和p75NTR陰性食管鱗癌細(xì)胞差異表達(dá)功能基因篩選
　　目的：對(duì)比 p75NTR+和 p75 NTR—食管鱗癌細(xì)胞基因表達(dá)譜差異，探尋并篩選p75

5、NTR+食道鱗癌細(xì)胞中干細(xì)胞特性相關(guān)基因的表達(dá)，為從腫瘤干細(xì)胞角度研究食管腫瘤的發(fā)病機(jī)理和尋找新的治療靶點(diǎn)提供線索。
　　方法：采用全基因組表達(dá)譜芯片對(duì)p75NTR+和p75NTR—細(xì)胞進(jìn)行基因表達(dá)譜差異分析及篩選，并對(duì)篩選出的顯著差異表達(dá)基因，應(yīng)用RT-PCR方法比較部分基因豐度。
　　結(jié)果：在食管鱗癌細(xì)胞中p75NTR+細(xì)胞較p75NTR—細(xì)胞，Bmi-1和EZH2顯著高表達(dá)（P＜0.01）；根據(jù)生物學(xué)功能分類結(jié)果，初步

6、篩選出和干細(xì)胞特性密切相關(guān)的與TGF-β和Wnt信號(hào)途徑相關(guān)的上調(diào)基因共12條。
　　結(jié)論：p75NTR+與p75 NTR—細(xì)胞比較，p75NTR+食管鱗癌細(xì)胞高表達(dá)與干細(xì)胞特性相關(guān)基因（Bmi-1、EZH2），進(jìn)一步證實(shí)了p75NTR+食管鱗癌細(xì)胞具有腫瘤干細(xì)胞特性。并為尋找食管鱗癌干細(xì)胞靶向治療提供線索。
　　第三部分 RNA干擾沉默EZH2基因?qū)75NTR陽性食管鱗癌細(xì)胞增殖及侵襲的影響
　　目的：以第二部分篩

7、選的差異基因EZH2為目的基因，通過干擾沉默目的基因后，對(duì)p75NTR+食管鱗癌細(xì)胞增殖及侵襲有何影響。
　　方法：以EZH2基因?yàn)榘悬c(diǎn)，設(shè)計(jì)構(gòu)建其干擾小RNA的表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染p75NTR+食管鱗癌細(xì)胞，之后通過一系列實(shí)驗(yàn)，評(píng)價(jià) RNA干擾沉默 EZH2基因后對(duì)p75NTR+食管鱗癌細(xì)胞增殖及侵襲的影響
　　結(jié)果：p75NTR+食管鱗癌細(xì)胞中成功轉(zhuǎn)染了干擾EZH2基因表達(dá)小RNA載體，細(xì)胞轉(zhuǎn)染后，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞倍增時(shí)間較對(duì)照組明