Bufalin對人食管癌細胞ERK-P-ERK和細胞遷移能力的影響.pdf

1、食管癌是人類常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)生是多因素作用、多基因參與、多階段共同發(fā)展的疾病，然而其發(fā)生發(fā)展的確切機制尚不明確。我國是世界上食管癌死亡率最高的國家之一，每年有不少人死于食管癌。由于其早期癥狀不明顯，不易察覺，到確診時已屬中晚期，故預后較差。盡管近些年來通過普查使得食管癌早發(fā)現(xiàn)早診斷早治療的水平有所提高，食管癌的預后有所改善，但五年生存率仍較低。因此，繼續(xù)尋找新的抗腫瘤藥物，并了解其在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中作用的信號轉(zhuǎn)導通路成為食管癌

2、臨床治療研究的重點。
　　 本實驗主要研究了ERK信號轉(zhuǎn)導通路，即Ras-Raf-MEK-ERK三級酶促級聯(lián)反應，并通過轉(zhuǎn)染高活性MEK質(zhì)粒來研究食管癌細胞中ERK/p-ERK及細胞遷移能力的變化，進而得知高活性MEK質(zhì)粒對人食管癌細胞中ERK信號通路的生物學作用，通過使用Bufalin（即蟾蜍靈，是從中華大蟾蜍或黑眶蟾蜍的耳后腺及皮膚腺的干燥分泌物提取的主要活性成分之一，屬于一種強心苷類物質(zhì)，已被用來作為一種傳統(tǒng)的中醫(yī)治療感染

3、、腫瘤以及麻醉）來有效的阻斷通路信號的異常傳導，降低各個因子的活化水平，從而達到抑制腫瘤因子異常增殖和遷移的作用。Bufalin在臨床上多有報道，但尚未應用于食管癌的治療，本實驗室的前期實驗證實，Bufalin可通過ERK信號轉(zhuǎn)導通路來下調(diào)細胞內(nèi)p-Raf、p-MEK、p-ERK的水平，而Raf、MEK、ERK則無明顯變化，提示Bufalin可能通過抑制ERK通路中各個因子的活化達到抑制食管癌發(fā)生發(fā)展的作用。本實驗就此在Bufalin對

4、人食管癌細胞中ERK/p-ERK和細胞遷移能力的影響方面進行研究，從而多方面驗證Bufalin在食管癌中的作用，為臨床能夠更好的治療食管癌提供可靠的實驗依據(jù)與新的治療方向。
　　 為了更好的研究食管癌發(fā)生發(fā)展的具體機制以及治療食管癌的方案，本實驗繼續(xù)使用了食管癌細胞株TE13進行人體外的研究，旨為了解在食管癌發(fā)生發(fā)展過程中Bufalin在ERK通路中所發(fā)揮的具體作用，并為更好的服務于臨床打下堅實的基礎(chǔ)。
　　 目的:探討

5、Bufalin對人食管癌細胞ERK/p-ERK和細胞遷移能力的影響
　　 方法:
　　 1將攜帶高活性MEK基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至DH5α大腸桿菌中進行擴增，并使用脂質(zhì)體法將攜帶高活性MEK基因的質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染到食管癌TE13細胞中，使用WesternBlot方法分別檢測轉(zhuǎn)染質(zhì)粒0h、24h、30h、36h、42h、48h后細胞內(nèi)ERK表達及其活化情況的變化，并得出轉(zhuǎn)染的最佳時間。
　　 2用WesternBlot方法分

6、別檢測不同處理組（對照組、空載體轉(zhuǎn)染組、高活性MEK質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組、轉(zhuǎn)染后加Bufalin組）中細胞內(nèi)ERK及其活化情況的蛋白表達，進而研究轉(zhuǎn)染高活性MEK質(zhì)粒及Bufalin對ERK通路的影響。
　　 3采用細胞劃痕實驗分別測量不同處理組（普通培養(yǎng)組、空載體轉(zhuǎn)染組、高活性MEK質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組、轉(zhuǎn)染后加Bufalin組、轉(zhuǎn)染后加Uo126組、Bufalin和Uo126聯(lián)合應用組）36h后細胞遷移的距離，并與對照組作比較，進而研究不同處理

7、組對細胞遷移能力的影響。
　　 結(jié)果:
　　 1成功將高活性MEK質(zhì)粒擴增并轉(zhuǎn)染到食管癌細胞中，并檢測到其下游基因ERK在不同處理組間蛋白水平無明顯變化(0.542±0.015，0.687±0.020,0.576±0.019,0.579±0.016,0.475±0.011,0.611±0.006，P＞0.05)，無顯著性差異。而p-ERK在對照組和空載體組中亦無明顯變化，但在高活性MEK質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組中的活化水平明顯升高，且

8、隨轉(zhuǎn)染后時間的增加(0h、24h、30h、36h)表達量逐漸升高，至36小時達到最高值，此后(42h、48h)表達量開始下降(0.756±0.035，0.663±0.040，0.714±0.053，1.314±0.053，0.663±0.034，0.704±0.009，P＜0.05)，差異具有統(tǒng)計學意義。
　　 2WesternBlot結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)染高活性MEK質(zhì)粒36h后，ERK蛋白的表達在不同處理組間無明顯差別(0.800±

9、0.003，0.714±0.034，0.759±0.022，0.750±0.026，P＞0.05)，而ERK的活化水平p-ERK在轉(zhuǎn)染組的表達明顯高于對照組和空載體組，當轉(zhuǎn)染后加入Bufalin后，p-ERK的水平又受到抑制，明顯下降(0.381±0.026，0.400±0.017，0.698±0.010，0.432±0.007，P＜0.05)，差異具有統(tǒng)計學意義。
　　 3劃痕實驗結(jié)果顯示:不同的處理組在劃痕36h后與對照組相

10、比遷移的距離不同，在高活性MEK質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組明顯大于其他各組，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，而Bufalin和Uo126聯(lián)合應用組細胞遷移的距離又明顯低于單純應用Bufalin和Uo126組，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，Bufalin組和Uo126組差異不明顯(P＞0.05)(4.100±0.200，4.200±0.265，10.333±0.252,6.683±0.058,7.033±0.158,3.933±0.153)。<

11、br>　　 結(jié)論:
　　 1直接轉(zhuǎn)染高活性的MEK質(zhì)?？蛇M一步激活其下游的ERK，使p-ERK的水平升高，且在轉(zhuǎn)染后36h時活化水平達到最高值。而ERK的表達并不受轉(zhuǎn)染時間的影響。
　　 2轉(zhuǎn)染高活性MEK質(zhì)?？梢允辜毎麅?nèi)p-ERK的水平明顯升高，加入Bufalin后又可以顯著抑制ERK的活化，使p-ERK的水平又降低。而ERK的表達在不同處理組間無明顯變化。
　　 3Bufalin對食管鱗狀細胞癌TE13細胞