TAMs對食管癌相關(guān)淋巴管內(nèi)皮細胞增殖和遷移能力的影響.pdf

1、目的:
　　食管癌是消化系統(tǒng)比較常見的惡性腫瘤之一，對人類的生命與健康產(chǎn)生極大的危害。我國食管癌的發(fā)病率高居于世界首位，80％的患者發(fā)病年齡在50歲以后，男性高于女性。近幾年來食管癌的發(fā)病年齡逐漸趨于年輕化。在我國食管癌的發(fā)病地區(qū)具有明顯的地域性，特別是在太行山脈附近的省份發(fā)病率明顯偏高。由于早期食管癌臨床癥狀并不明顯，患者多在出現(xiàn)吞咽困難、咽下疼痛時才就診，確診時往往已經(jīng)到了中晚期，且多發(fā)生了淋巴道轉(zhuǎn)移，治療效果欠佳。
　

2、　腫瘤相關(guān)巨噬細胞(tumor associated macrophages，TAMs)是腫瘤組織中作用最強及數(shù)量最多的炎性細胞。目前根據(jù)巨噬細胞的活化狀態(tài)和在機體中發(fā)揮功能的不同，巨噬細胞主要分為M1型巨噬細胞和M2型巨噬細胞。M1型巨噬細胞可殺滅腫瘤細胞并抑制腫瘤淋巴管及血管形成，而M2型巨噬細胞主要促進腫瘤淋巴管及血管生成。已知的促進淋巴管生成的主要調(diào)控因子是血管內(nèi)皮生長因子-C(vascular endothelial grow

3、th factor-C，VEGF-C)，其可與淋巴管內(nèi)皮細胞表面的特異性受體血管內(nèi)皮生長因子受體-3(vascular endothelial growth factorreceptor-3，VEGFR-3)結(jié)合，誘導其發(fā)生酪氨酸激酶磷酸化，從而促進腫瘤周圍新的淋巴管生成，為腫瘤淋巴道的轉(zhuǎn)移提供了通道。除了腫瘤細胞可分泌VEGF-C，腫瘤相關(guān)巨噬細胞也可分泌。基于M1型與M2型巨噬細胞的作用不同，本實驗擬通過體外培養(yǎng)人單核細胞，將其誘導

4、成M2型巨噬細胞，并繼續(xù)誘導M2型巨噬細胞觀察是否向M1型巨噬細胞轉(zhuǎn)化。將人單核細胞系THP-1細胞分別誘導為M1型和M2型巨噬細胞并與食管癌相關(guān)淋巴內(nèi)皮細胞(lymphaticendothelial cell，LEC)共培養(yǎng)，以單獨培養(yǎng)的食管癌相關(guān)LEC作為對照組;通過CCK-8法、Transwell小室遷移實驗及基質(zhì)膠三維培養(yǎng)法觀察不同類型的巨噬細胞對食管癌相關(guān)LEC的增殖、遷徙和成環(huán)能力的影響，同時通過ELISA法來檢測不同類型巨

5、噬細胞分泌VEGF-C的情況;通過Western Blot法檢測食管癌相關(guān)LEC經(jīng)條件培養(yǎng)基培養(yǎng)后VEGFR-3蛋白表達情況;通過qRT-PCR法來檢測VEGFR-3mRNA的表達情況，探討M2型巨噬細胞能否向M1型轉(zhuǎn)化，及探討不同類型的巨噬細胞對食管癌相關(guān)LEC增殖、遷移和成環(huán)能力的影響。
　　方法:
　　1、誘導人單核細胞向M2型巨噬細胞轉(zhuǎn)化，并誘導M2型巨噬細胞向M1型巨噬細胞轉(zhuǎn)化
　　1)采用密度梯度離心法及磁

6、珠陽性分選法獲得人單核細胞，經(jīng)重組人巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)誘導其轉(zhuǎn)化為M2型巨噬細胞，并采用流式細胞儀進行鑒定。
　　2) M2型巨噬細胞經(jīng)干擾素-γ（IFN-γ）和磷酸脂多糖(LPS)共同誘導向M1型巨噬細胞轉(zhuǎn)化，并采用流式細胞儀進行鑒定。
　　2、將M1型和M2型巨噬細胞與食管癌相關(guān)淋巴內(nèi)皮細胞共培養(yǎng)并檢測相關(guān)指標
　　1)將THP-1細胞經(jīng)佛波酯(PMA)誘導2d后，經(jīng)IFN-γ和LPS誘導2d為M1

7、型巨噬細胞;經(jīng)白介素-4(IL-4)誘導2d為M2型巨噬細胞，采用流式細胞儀進行鑒定。
　　2)分別留取M1型巨噬細胞和M2型巨噬細胞的條件培養(yǎng)基。
　　3)以M1型巨噬細胞條件培養(yǎng)基培養(yǎng)的食管癌相關(guān)LEC作為M1組;以M2型巨噬細胞條件培養(yǎng)基培養(yǎng)的食管癌相關(guān)LEC作為M2組;以RM1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)的食管癌相關(guān)LEC作為對照組。
　　4)采用CCK-8法檢測各組不同培養(yǎng)基對食管癌相關(guān)LEC的增殖能力的影響。

8、>　　5)采用Transwell小室來觀察各組不同培養(yǎng)基培養(yǎng)對食管癌相關(guān)LEC遷移能力的影響。
　　6)采用基質(zhì)膠法來觀察各組不同培養(yǎng)基培養(yǎng)對食管癌相關(guān)LEC成環(huán)能力的影響。
　　7)采用ELISA法檢測M1型巨噬細胞和M2型巨噬細胞上清液中VEGF-C水平。
　　8)采用Western Blot法檢測各組不同培養(yǎng)基培養(yǎng)后的食管癌相關(guān)LEC中VEGFR-3蛋白表達水平。
　　9)采用qRT-PCR法檢測各組不同培

9、養(yǎng)基培養(yǎng)培養(yǎng)后的食管癌相關(guān)LEC中VEGFR-3mRNA表達情況。
　　3、統(tǒng)計學處理
　　應用SPSS17.0軟件進行處理數(shù)據(jù)。對于兩樣本定量資料我們選用t檢驗。對于單因素定量資料多組樣本之間的比較我們采用單因素方差分析法，多組均數(shù)之間的兩兩比較則采用LSD-t法，檢驗水準α=0.05。
　　結(jié)果：
　　1.經(jīng)M-CSF誘導后M2型巨噬細胞陽性表達率為(66.37±2.67)％，明顯多于M1型巨噬細胞陽性表達率

10、（13.37±4.41）％，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。而M2型巨噬細胞再經(jīng)IFN-γ和LPS誘導后M1型巨噬細胞的陽性表達率為（48.57±5.98）％，明顯高于M2型巨噬細胞的陽性表達率（25.83±1.95）％，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05），且M1型巨噬細胞的陽性表達量較單核細胞經(jīng)M-CSF誘導后明顯增高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05）。
　　2.THP-1細胞經(jīng)PMA誘導后，經(jīng)IFN-γ與LPS誘導為M1型巨噬

11、細胞;經(jīng)IL-4誘導為M2型巨噬細胞。經(jīng)流式細胞儀檢測M1型巨噬細胞的CD16陽性表達率為（73.57±2.58）％，M2型巨噬細胞的CD163陽性表達率為（86.3±2.66）％。
　　3.CCK-8法檢測各組不同培養(yǎng)基對食管癌相關(guān)LEC增殖能力的影響:各組增殖能力M2組＞對照組＞M1組，M2組與M1組及與對照組兩兩比較差異具顯著性(P＜0.05)。而對照組與M1組進行比較差異無顯著性(P＞0.05)。
　　4.Trans

12、well小室觀察各組不同培養(yǎng)基對食管癌相關(guān)LEC遷移能力的影響:各組穿膜細胞數(shù)M2組＞對照組＞M1組，M2組與M1組及與對照組兩兩比較差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。對照組與M1組進行比較具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　5.基質(zhì)膠實驗法三維培養(yǎng)觀察各組不同培養(yǎng)基培養(yǎng)對食管癌相關(guān)LEC成環(huán)能力的影響:各組的成環(huán)數(shù)M2組＞對照組＞M1組，M2組與M1組及與對照組兩兩比較差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。對照組與M1組進行比

13、較具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。
　　6.ELISA法檢測M1型巨噬細胞和M2型巨噬細胞上清液中VEGF-C的水平結(jié)果:M2組＞對照組＞M1組，M2組與M1組及與對照組兩兩比較差異具顯著性(P＜0.05)。而對照組與M1組進行比較差異無顯著性（P＞0.05）。
　　7.Western Blot法檢測各組不同培養(yǎng)基培養(yǎng)后的食管癌相關(guān)LEC中VEGFR-3蛋白表達水平:M2組＞對照組＞M1組，M2組與M1組及與對照組兩兩比較差

14、異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。對照組與M1組進行比較具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。
　　8.采用qRT-PCR法檢測各組不同培養(yǎng)基培養(yǎng)后的食管癌相關(guān)LEC中VEGFR-3mRNA表達水平:M2組VEGFR-3mRNA表達量是對照組的3.01倍，M1組是對照組的0.90倍。M2組與對照組及與M1組兩兩比較均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，對照組與M1組進行比較無統(tǒng)計學意義(P＞0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.人M2